Ein optimierter Nurr1-Agonist sorgt für Krankheit

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4283 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Kernrezeptor Nurr1 ist sowohl für die Entwicklung als auch für den Erhalt von Dopamin-Neuronen im Mittelhirn von entscheidender Bedeutung und stellt ein vielversprechendes molekulares Ziel für die Parkinson-Krankheit (PD) dar. Wir haben zuvor drei Nurr1-Agonisten (Amodiaquin, Chloroquin und Glafenin) identifiziert, die ein identisches chemisches Gerüst haben, 4-Amino-7-chlorchinolin (4A7C), was auf eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung hindeutet. Hier berichten wir über eine systematische Suche in der medizinischen Chemie, bei der über 570 4A7C-Derivate generiert und charakterisiert wurden. Mehrere Verbindungen steigern die Transkriptionsaktivität von Nurr1 und führen zur Identifizierung eines optimierten, hirndurchdringenden Agonisten, 4A7C-301, der in vitro starke neuroprotektive Wirkungen zeigt. Darüber hinaus schützt 4A7C-301 die Dopaminneuronen des Mittelhirns im MPTP-induzierten männlichen Mausmodell der Parkinson-Krankheit und verbessert sowohl motorische als auch nichtmotorische Riechdefizite ohne dyskinesieähnliches Verhalten. Darüber hinaus lindert 4A7C-301 neuropathologische Anomalien erheblich und verbessert motorische und olfaktorische Dysfunktionen in AAV2-vermittelten α-Synuclein-überexprimierenden männlichen Mausmodellen. Diese krankheitsmodifizierenden Eigenschaften von 4A7C-301 rechtfertigen möglicherweise eine klinische Bewertung dieser oder analoger Verbindungen zur Behandlung von Patienten mit Parkinson.

Die Parkinson-Krankheit (PD), von der 2–3 % der Bevölkerung über 65 Jahre betroffen sind, ist nach der Alzheimer-Krankheit die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung1,2,3. Die selektive Degeneration von Dopamin-Neuronen (mDANs) im Mittelhirn in der Substantia nigra und die Akkumulation und Aggregation von neurotoxischem α-Synuclein (αSyn) in Lewy-Körpern sind charakteristische pathologische Merkmale der Parkinson-Krankheit. Es wird angenommen, dass die Manifestation der Parkinson-Krankheit durch die kombinierte Wirkung genetischer und umweltbedingter Faktoren über mehrere interagierende Wege verursacht wird, darunter mitochondriale Dysfunktion, oxidativer Stress, Neuroinflammation und dysregulierter Proteinabbau/Autophagie3,4,5,6,7. Derzeit ist die Dopamin (DA)-Ersatztherapie (z. B. L-DOPA) der Goldstandard der Behandlung. Während es die Lebensqualität von PD-Patienten erheblich verbessert, verringern sich sowohl das therapeutische Fenster ohne inakzeptable Nebenwirkungen wie Dyskinesien als auch der Grad des Nutzens mit der Zeit8,9, und es gibt keine Behandlung, die das Fortschreiten der Krankheit stoppen oder verlangsamen kann. Daher besteht ein großer ungedeckter Bedarf an der Entwicklung einer neuartigen krankheitsmodifizierenden Behandlung für PD10,11.

In den letzten Jahrzehnten wurden die Transkriptionsregulationskaskaden von mDANs umfassend untersucht12. Zwei wichtige mDAN-Entwicklungswege (d. h. Sonic Hedgehog-FoxA2 und Wnt1-Lmx1A) konvergieren, um Nurr113,14,15 zu induzieren, was Nurr1 als Hauptregulator für mDANs hervorhebt. Tatsächlich haben Nurr1-Knockout- (KO) und bedingte KO-Mausstudien gezeigt, dass Nurr1 nicht nur für die Entwicklung16, sondern auch für die Aufrechterhaltung erwachsener mDANs17 essentiell ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nurr1 mDANs vor dem durch Neuroinflammation verursachten Tod schützt, indem es die Expression neurotoxischer proinflammatorischer Gene unterdrückt4. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Nurr1-Expression im Gehirn sowohl älterer als auch sporadischer Parkinson-Patienten deutlich verringert ist18,19,20.

Nurr1 gehört zur Unterfamilie der Kernrezeptoren NR4A, was darauf hindeutet, dass seine Transkriptionsfunktion durch synthetische und/oder endogene Liganden moduliert werden kann21. Darüber hinaus kann Nurr1 je nach zellulärem Kontext als Transkriptionsaktivator und als Repressor fungieren (z. B. in mDANs16 bzw. Mikroglia4). Um zu untersuchen, ob Nurr1 ein molekulares Ziel für die krankheitsmodifizierende Behandlung von PD22 sein könnte, haben wir Hochdurchsatz-Assaysysteme eingerichtet und zuvor eine Bibliothek von von der US-FDA zugelassenen Medikamenten gescreent. Wir haben drei Medikamente identifiziert, nämlich Amodiaquin (AQ), Chloroquin (CQ) und Glafenin, die die Transkriptionsaktivität von Nurr1 durch direkte Bindung an seine Ligandenbindungsdomäne (LBD) deutlich steigern23. Alle drei Medikamente hatten ein identisches chemisches Grundgerüst, nämlich: 4-Amino-7-chlorchinolin (4A7C), was uns zu der Hypothese veranlasst, dass dieses 4A7C-Motiv eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) darstellt, die zur Identifizierung besserer 4A7C-Derivate mit höherer Wirksamkeit und geringeren Nebenwirkungen durch SAR-basierte Arzneimittel verwendet werden könnte Chemie24. Im Einklang mit dieser Hypothese zeigen neuere Arbeiten von Munoz-Tello et al. 25 und Willems et al. 26,27 zeigten, dass AQ und CQ und ihre Derivate als Nurr1-Agonisten wirken können. Willems et al. 26 berichteten auch, dass die Entfernung der 7-Chlor- oder der 4-Aminogruppe des 4A7C-Pharmakophors zu einem Aktivitätsverlust führt, was unsere Hypothese weiter stützt, dass 4A7C ein gültiges Pharmakophor für die Entwicklung wirksamer Nurr1-Agonisten ist. Zu diesem Zweck führten wir eine systematische medizinisch-chemische Untersuchung durch und verwendeten CQ als Ausgangsverbindung, da es relativ sicher ist und immer noch häufig zur Behandlung menschlicher Krankheiten wie Malaria und Autoimmunerkrankungen eingesetzt wird28. Wir haben mehrere (>570) 4A7C-Derivate mithilfe biochemischer, molekularer und zellulärer Tests charakterisiert und einen endgültigen Kandidaten, 4A7C-301, identifiziert, der eine deutlich höhere Wirksamkeit aufweist und mechanismusbasierte neuroprotektive Wirkungen sowohl in In-vitro- als auch In-vivo-Modellen der Parkinson-Krankheit bietet , getrennt unter Verwendung sowohl eines umweltbedingten (der mitochondriale Komplex-I-Inhibitor 1-Methyl-4-Phyenylpyridinium (MPP+)) als auch eines genetischen (αSyn) Risikofaktormodells der Parkinson-Krankheit. Im Gegensatz zu L-DOPA oder CQ verbesserte 4A7C-301 sowohl motorische als auch nichtmotorische Dysfunktionen deutlich, ohne Nebenwirkungen wie dyskinesieähnliche Verhaltensweisen oder Autophagie-Hemmung. Unsere Daten belegen den Grundsatzbeweis, dass optimierte Nurr1-Agonisten eine krankheitsmodifizierende Behandlung sowohl für sporadische als auch familiäre Parkinson-Krankheit bieten können.

Zuvor hat unsere Gruppe wirksame Anti-Malaria-Hybride entwickelt und synthetisiert, die gegen arzneimittelresistente P. falciparum-Stämme wirksam sind29,30,31,32. Diese Hybride basierten auf der Verknüpfung des 4A7C-Pharmakophors mit anderen Antimalaria-Pharmakophoren (wie Triazinen/Pyrimidinen) über einen flexiblen Alkylkettenverknüpfer, ähnlich dem von CQ. Wir spekulierten, dass einige dieser 4A7C-Derivate die Transkriptionsfunktion von Nurr1 aktivieren würden, wenn 4A7C ein gültiger SAR wäre. Tatsächlich haben wir mithilfe unserer etablierten Nurr1-Reporter-Assays23,33 herausgefunden, dass etwa 20 % dieser Derivate eine nachweisbare Aktivierung der Nurr1-Funktion aufwiesen. Wir beobachteten auch, dass, wenn das 4A7C-Pharmakophor an einen substituierten Triazin- oder Pyrimidinring gebunden ist, es eine deutliche Nurr1-Aktivierung zeigte (EC50/maximale Induktion bis zu 1,10 µM/4,76-fach für 4A7C-Triazine und bis zu 121,22 nM/5,08-fach). für 4A7C-Pyrimidine; siehe Abb. 1a). Das 4A7C-Pyrimidin-Hybrid 4A7C-101 erwies sich als erste Leitverbindung, die Nurr1 mit einem niedrigeren EC50-Wert (121,22 nM) als CQ (50,25 µM) aktivierte, und wurde zur weiteren Optimierung ausgewählt (Abb. 1a; Ergänzungstabelle 1). Anschließend wurde ein umfassendes Leitoptimierungsprogramm durchgeführt, um die Auswirkungen struktureller Modifikationen an den drei Hauptmodifikationsstellen von 4A7C-101 (Abb. 1b) zu bewerten, was zur Erzeugung zusätzlicher 4A7C-Derivate (~470) führte. Diese SAR-Analyse ergab wichtige Punkte für die weitere Optimierung der 4A7C-Pyrimidin-Derivate (siehe Abb. 1b). Erstens zeigte ein flexibler und kurzer (C2-C3) Diamino-aliphatischer Kettenlinker, der das 4A7C mit dem Pyrimidinring verbindet, eine gute Aktivität. Wenn Piperazin als Linker verwendet wurde (starr, kein freies -NH an der 4. Position des Chinolins), ging die Aktivität verloren, was auf die Wesentlichkeit der 4-Aminogruppe des Chinolinrings hinweist. Das andere –NH des Linkers (der den Pyrimidinring verbindet) kann unter Beibehaltung der Aktivität ersetzt oder sogar entfernt werden. Verbindungen mit dem Substituenten –CH2-1,3-Benzodioxol oder –CH2-Thiophen zeigten eine gute Aktivität (siehe Verbindungen 4A7C-501 bis 4A7C-508 in der Ergänzungstabelle 1). Ein hybrider aliphatischer Ketten-Piperazin-Linker zeigte ebenfalls eine gute Wirksamkeit (siehe Verbindungen 4A7C-201 bis 4A7C-208 in der Ergänzungstabelle 1). Der Ersatz von Amodiaquins –OH durch –F zur Bildung von Fluor-Amodiaquin-Pyrimidinen führte zu einem Aktivitätsverlust, was auf die Bedeutung der phenolischen Hydroxylgruppe des AQ für die Nurr1-Aktivität hinweist (was auch mit Merk et al. 26 übereinstimmt). Zweitens spielt beim Pyrimidinring auch die Pyrimidin-Regiochemie eine Rolle bei der Aktivität, aber die Aktivität hängt von den Substituenten am Pyrimidinring und am Linker ab. Wenn anstelle von Pyrimidin ein Chinazolinring (ein kondensiertes Pyrimidin) verwendet wurde, blieb die Aktivität erhalten, es wurde jedoch ein leichter Rückgang beobachtet. Drittens verringerten Substituenten mit freier NH-Gruppe (z. B. Aminoalkohole) bei Pyrimidinringsubstituenten die Aktivität, während carbocyclische Aminsubstituenten für eine gute Aktivität wichtig waren. In einigen Fällen zeigten auch Moleküle mit -Cl-Substituenten (Zwischenprodukte bis zu Endverbindungen) Aktivität.

a, b Entwicklung von 4A7C-Pyrimidin-Konjugaten als potente Nurr1-Agonisten aus CQ basierend auf der Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) mit einem identischen Gerüst, 4-Amino-7-chlorchinolin (4A7C; in roter Farbe dargestellt); (i), (ii), (iiia)/(iiib) bezeichnen die Stellen struktureller Modifikationen an 4A7C-Pyrimidinen. c Syntheseschema für 4A7C-301; Reaktionsbedingungen: (i) unverdünnt, 120 °C, 8 h, 90 %; (ii) Triethylamin, THF, 60 °C, 12 h, 28 % (5A), 53 % (5B); (iii) unverdünnt, versiegeltes Röhrchen, 110 °C, 5 h, 65 %. d, e Luciferase-Assays unter Verwendung von Nurr1-LBD (c) oder Nurr1 voller Länge (d) in SK-N-BE(2)C-Zellen. *P < 0,05, ****P < 0,0001 im Vergleich zur Kontrolle (CTL), Zwei-Wege-ANOVA, Dunnetts Post-hoc-Test; n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung des Luciferase-Assays zur Bestimmung der Wirkung von CQ (100 µM) und 4A7C-301 (20 µM) unter Verwendung der LBD von Mitgliedern der NR4A-Unterfamilie in SK-N-BE(2)C-Zellen. Prostaglandin A1 (PGA1, 10 µM) und Cytosporon B (10 µM) wurden als Positivkontrollen der Nor1- bzw. Nur77-Aktivierung verwendet. n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± sem g-Luciferase-Assay unter Verwendung von Punktmutanten auf potenziellen Nurr1-LBD-Bindungsresten in SK-N-BE(2)C-Zellen. P < 0,0001 im Vergleich zu CQ oder 4A7C-301 behandeltem Wildtyp (WT), Zwei-Wege-ANOVA, Dunnett-Post-hoc-Test; n = 4 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung h. Konkurrenzanalyse von CQ oder 4A7C-301 mit [3H]-CQ für die Bindung an Nurr1-LBD. Als Negativkontrolle wurde Retinsäure (RA) verwendet. n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± sdi, zeitaufgelöster Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Assay (TR-FRET), der eine dosisabhängige Konkurrenz von CQ oder 4A7C-301 mit fluoreszenzmarkiertem Hydroxy-CQ (HCQFluo) um die Bindung an Nurr1-LBD zeigt. n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Es wurde beobachtet, dass Substituenten im Pyrimidinring einen großen Einfluss auf die gesamte Nurr1-Aktivität der 4A7C-Pyrimidinderivate haben, weshalb wir unsere Bemühungen weiter auf die Optimierung der Substituenten im Pyrimidinring richten. Verbindung 4A7C-102, analog zu 4A7C-101, aber mit einem N-Ethylpiperazin-Substituenten in der Position-2 des Pyrimidinrings, war die zweitbeste bisher identifizierte Verbindung (3,68-fache Aktivierung bei EC50 von 143,13 nM). Anschließend erwogen wir die Möglichkeit, die –Me-Gruppe an der 4. Position des Pyrimidinrings von 4A7C-101 durch andere Substituenten zu ersetzen und dabei zunächst den Piperidinsubstituenten von 4A7C-101 konstant zu halten, um seine Rolle bei der Nurr1-Aktivität zu verstehen. 4A7C-101-Analoga, in denen der –Me-Substituent durch einen –Ph-Substituenten, einen –CF3-Substituenten, einen –Cl-Substituenten oder ein –H-Atom ersetzt wurde, zeigten eine verminderte Nurr1-Aktivierung. Wir untersuchten auch den Einfluss eines kürzeren C2-Linkers und der Pyrimidin-Regiochemie und stellten fest, dass die Verbindung 4A7C-103 mit einer anderen Pyrimidin-Regiochemie und einem –Cl-Substituenten sowie einem N-Ethylpiperazin-Substituenten eine verminderte Nurr1-Aktivität beibehielt. Darüber hinaus zeigte die analoge Verbindung 4A7C-104 mit einem einzigen Unterschied zum C2-Linker anstelle eines C3-Linkers ein besseres Nurr1 EC50 als 4A7C-103 (siehe ergänzende Tabelle 1). Als nächstes untersuchten wir den Einfluss der Disubstitution mit verschiedenen zyklischen Aminen an der 4. und 6. Position des Pyrimidinrings und der Beibehaltung der Linkerkettenlänge von 2 Kohlenstoffatomen (dh 1,2-Diaminoethan-Linker). Um den Einfluss der Ringgröße und Sperrigkeit zyklischer Amine auf die Nurr1-Aktivierung zu verstehen, wurde im ersten Schritt das Pyrimidin durch Pyrrolidin (5-gliedriger Ring), Piperidin (6-gliedriger Ring) und Azepan (7-gliedriger Ring) disubstituiert ). Die 6-gliedrige Piperidin-1-yl-substituierte Verbindung 4A7C-302 zeigte die maximale Aktivierung (5,19-fach bei EC50 von 950,63 nM). Im nächsten Schritt werden weitere 6-gliedrige Cycloamin-Substituenten, nämlich Morpholin, N-Methylpiperazin und N-Ethylpiperazin wurden als Disubstituenten am Pyrimidinring eingeführt. Darunter ist 4A7C-301 zu sehen, dessen Bindungspunkt an den Linker die 2. Position des Pyrimidinrings ist und der zwei 4-Ethylpiperazin-1-yl-Substituenten an der 4. und 6. Position des Pyrimidinrings aufweist die höchste Nurr1-Aktivierung zusammen mit einem deutlich niedrigeren EC50-Wert im Vergleich zu CQ. Seine Regiomerverbindung 4A7C-303 zeigte ebenfalls eine gute Aktivität, jedoch mit einer geringeren Induktion als 4A7C-301. Wir hielten auch die Aktivität, die dem 4-Ethyl-Piperazin-1-yl-Substituenten an der 4. Position verleiht, konstant und variierten die zyklischen Aminsubstituenten an der 6. Position mit Piperidin, Morpholin und N-Methylpiperazin (Derivate 4A7C-304, 4A7C-305). bzw. 4A7C-306). Obwohl diese Derivate gute Nurr1-Aktivitäten zeigten (in der Reihenfolge: N-Methylpiperazin > Morpholin > Piperidin), weist das Derivat 4A7C-301 die höchste Induktion (18,12-fach) und einen deutlich niedrigeren EC50-Wert (6,53 µM) als CQ (50,25 µM) auf. wurde als präklinischer Kandidat für weitere Studien ausgewählt (Abb. 1c; Ergänzungstabelle 1). Die Gehirnpermeabilität von 4A7C-301 wurde durch Analyse von Blutplasma und Gehirnhomogenaten zu verschiedenen Zeitpunkten nach oraler Verabreichung an SD-Ratten (20 mg/kg) bewertet ). 4A7C-301 drang gut in das Gehirn ein und blieb konstant im Gehirn erhalten (ergänzende Abbildung 1a – c).

Um die Wirksamkeit von 4A7C-Derivaten bei der Förderung der Transkriptionsaktivität von Nurr1 zu beurteilen, verwendeten wir zunächst die menschliche Neuroblastom-Zelllinie SK-N-BE(2)C, da sie sich aufgrund ihrer hohen Transfektionseffizienz ideal für Hochdurchsatz-Screenings eignet23,33. 4A7C-301 erhöhte die Transkriptionsaktivitäten sowohl von Nurr1-LBD (Abb. 1d) als auch von Nurr1 voller Länge (Abb. 1e) in dosisabhängiger Weise, mit einer höheren Wirksamkeit als CQ (EC50 betrug 7–8 und 50–70 µM). , jeweils). Als nächstes analysierten wir die Selektivität von CQ und 4A7C-301 gegenüber anderen Mitgliedern der NR4A-Unterfamilie (Nur77 und Nor1). Wie in Abb. 1f gezeigt, induzierten CQ und 4A7C-301 in SK-N-BE(2)C-Zellen die Transkriptionsaktivität von Nurr1 mit der größten Wirksamkeit (13–14-fach) unter den NR4A-Mitgliedern. Wir fanden auch heraus, dass beide Verbindungen die Transkriptionsaktivität von Nor1 deutlich aktivierten, jedoch mit geringerer Effizienz (3-4-fach). Im Gegensatz dazu aktivierten sie die Transkriptionsaktivität von Nur77 nicht, während der Nur77-Agonist Cytosporon B34 sie deutlich erhöhte. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass CQ/4A7C-301 selektiv die Transkriptionsaktivität von Nurr1, jedoch nicht von Nur77, gegenüber Nor1 aktiviert. Obwohl SK-N-BE(2)C-Zellen das Tyrosinhydroxylase (TH)-Gen exprimieren, sind sie nicht mDAN-Ursprung. Daher verglichen wir die Transkriptionsstärken von 4A7C-301 und CQ in der dopaminergen Zelllinie N27-A, die aus mDANs der Ratte stammt35,36. Bemerkenswerterweise zeigte 4A7C-301 in N27-A-Zellen eine etwa 50-mal höhere Wirksamkeit als CQ (EC50 betrug ~0,2 bzw. ~10 µM; ergänzende Abbildung 1d,e). Um herauszufinden, ob 4A7C-301 über die Interaktion mit Nurr1-LBD funktioniert, untersuchten wir die Auswirkungen spezifischer Nurr1-LBD-Mutationen an den gestörten Resten auf der Grundlage unserer früheren NMR-Titrationsstudien23,33,37. Obwohl diese Studien zeigten, dass AQ23, CQ37 und PGA1/PGE133 mit Nurr1-LBD interagieren, unterschieden sich die spezifischen interagierenden Reste zwischen diesen Agonisten deutlich. Nachdem wir 4A7C-301 unter den CQ-Derivaten ausgewählt hatten, wählten wir die Reste S441, I573, A586, I588, K590, L593, D594, T595, L596 und F598, die zuvor als CQ-interagierende Stellen identifiziert wurden. Eine signifikante Verringerung der Transkriptionsaktivität wurde höchstens in den Konstrukten mit Mutationen beobachtet (I573, I588, L593, D594, T595, L596 und F598), jedoch nicht in allen diesen Resten in ähnlichen Mustern wie CQ und 4A7C-301 (Abb. 1g). . Diese Ergebnisse bestätigen, dass diese Stellen für die Aktivierung und Interaktion zwischen Nurr1 und CQ/4A7C-301 von entscheidender Bedeutung sind, und zeigen außerdem, dass sowohl CQ ​​als auch 4A7C-301 Nurr1 über die direkte Bindung an Nurr1-LBD aktivieren. Mutationen an bestimmten Resten (z. B. S441, K590, L593 und D594) hatten keinen Einfluss auf die basale Transkriptionsaktivität, verringerten jedoch die CQ- oder 4A7C-301-induzierte Nurr1-Transkriptionsaktivität im Vergleich zum Wildtyp-Reporterkonstrukt. Als diese mutierten Konstrukte weiter getestet wurden, indem die transfizierten Zellen mit 4A7C-301 sowie mit PGA1 und AQ behandelt wurden, war die Transkriptionsaktivierung von Nurr1 durch 4A7C-301, nicht jedoch die durch AQ oder PGA1, deutlich verringert, was die Schlussfolgerung stützt, dass diese Reste sind 4A7C-301 (und CQ)-spezifisch (ergänzende Abbildung 2). Zusammengenommen legen diese ortsgerichteten Mutageneseanalysen nahe, dass verschiedene synthetische und native Agonisten von Nurr1 mit gemeinsamen sowie unterschiedlichen Resten innerhalb des Nurr1-LBD interagieren und spezifisch die Transkriptionsfunktion von Nurr1 aktivieren. Darüber hinaus zeigte der Radioligandenbindungs-/Kompetitionstest unter Verwendung von [3H]-CQ, dass CQ und 4A7C-301 mit [3H]-CQ um die Bindung an Nurr1-LBD mit IC50-Werten von 1,03 ± 0,61 µM bzw. 48,22 ± 22,05 nM konkurrieren können ( Abb. 1h). Darüber hinaus konkurrierte ein Ligandenbindungstest unter Verwendung eines zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanzenergietransfersystems (TR-FRET) zusammen mit fluoreszenzmarkiertem Hydroxy-CQ (HCQFluo), CQ und 4A7C-301 mit HCQFluo mit IC50-Werten von 2,33 ± 0,52 µM und 107,71 ± 14,14 nM (Abb. 1i). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 4A7C-301 eine 20-fach höhere Bindungsaffinität für Nurr1-LBD aufweist als CQ, was mit seiner höheren Wirksamkeit übereinstimmt. Bei Tests in einer anderen murinen dopaminergen Zelllinie zeigten MN9D38, 4A7C-301 erneut eine viel höhere Wirksamkeit (~ 50-fach) als CQ zur Aktivierung von Nurr1 (ergänzende Abbildung 3a, b).

Um festzustellen, ob CQ und 4A7C-301 neuroprotektive Wirkungen hervorrufen können, behandelten wir N27-A- und MN9D-Zellen, die dem Mitochondrienkomplex-I-Inhibitor 1-Methyl-4-Phyenylpyridinium (MPP+) ausgesetzt waren, mit CQ oder 4A7C-301. CQ und 4A7C-301 verringerten jeweils die MPP+-induzierte Zytotoxizität in dosisabhängiger Weise signifikant, und 4A7C-301 zeigte seine maximale Wirksamkeit bei einer etwa 20-mal niedrigeren Konzentration als CQ sowohl in N27-A (ergänzende Abbildung 1f, g) als auch in MN9D Zellen (Ergänzende Abb. 3c, d). Um zu bestätigen, dass diese neuroprotektiven Wirkungen von CQ/4A7C-301 Nurr1-abhängig sind, haben wir die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zytotoxizität gegenüber MPP+ unter Nurr1-Überexpressions- (OE) oder Knockdown-Zuständen (KD) in N27-A- und MN9D-Zellen getestet. Nurr1 OE verstärkte die neuroprotektiven Wirkungen von CQ (100 µM) und 4A7C-301 (1 µM) gegen MPP+ im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 2a, b; ergänzende Abb. 3e, f). Im Gegensatz dazu verringerte Nurr1 KD nicht nur die Lebensfähigkeit der Zellen in Abwesenheit von MPP+ erheblich (ca. 20 %), sondern hob auch die neuroprotektiven Wirkungen von CQ und 4A7C-301 gegen MPP+ sowohl in N27-A (Abb. 2a, b) als auch in vollständig auf MN9D-Zellen (ergänzende Abb. 3e, f), was stark darauf hindeutet, dass die Neuroprotektion durch CQ und 4A7C-301 über die Nurr1-Aktivierung erfolgt. Als nächstes untersuchten wir, ob mitochondriale Dysfunktion und/oder oxidativer Stress an der Lebensfähigkeit der Zellen beteiligt sind. Die Behandlung von N27-A-Zellen mit MPP+ induzierte stark die Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), wie durch Anfärben mit dem fluoreszierenden ROS-Indikator 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA) nachgewiesen wurde, die durch CQ (100 µM) deutlich reduziert wurde ) und 4A7C-301 (1 µM) (Ergänzende Abbildung 1i). Diese Effekte wurden durch Nurr1 OE verstärkt, durch Nurr1 KD jedoch verringert (ergänzende Abbildung 1i). Darüber hinaus löste die MPP+-Behandlung eine schwerwiegende mitochondriale Dysfunktion aus, die zu einer verringerten OXPHOS-Kapazität führte (ergänzende Abbildung 1j – o), die durch CQ (100 µM) und 4A7C-301 (1 µM) effizient wiederhergestellt wurde, wie durch einen Anstieg der Basalatmung gezeigt , maximale Atmung, ATP-Umsatz sowie Änderungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) nach FCCP-Injektion, wobei diese Effekte durch Nurr1 OE weiter verstärkt, durch Nurr1 KD jedoch fast vollständig aufgehoben wurden (ergänzende Abbildung 1j – o).

a, b Zelllebensfähigkeit analysiert durch MTT-Reduktion (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) (a) und Zytotoxizität gemessen durch Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung (b) mit Nurr1 OE und KD in N27-A-Zellen. ***P < 0,001, ****P < 0,0001 im Vergleich zur Vehikelbehandlung (VEH) unter Kontrollbedingungen; ###P < 0,001, ####P < 0,0001 im Vergleich zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen, Zwei-Wege-ANOVA, Tukey-Post-hoc-Test; n = 4 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung c. Repräsentative TH- (rot) und Iba-1-Immunfluoreszenzbilder (grün) aus MPP+- oder LPS-behandelten VM-Neuron-Glia-Kokulturen in Abwesenheit oder Anwesenheit von CQ oder 4A7C-301. Maßstabsbalken, 100 µm. d–g Quantifizierung von TH+-Neuronen (d, e) und Iba-1+-Mikroglia (f, g), gezählt und transformiert als Prozentsatz der Vehikelkontrolle (VEH), aus CQ (d, f) oder 4A7C-301 (e, g). ) behandelter Zustand. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zu 0 nM, mehrfacher ungepaarter zweiseitiger t-Test; n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus zwei biologisch unabhängigen Experimenten.

Die oben genannten Daten zeigten, dass die Aktivierung von Nurr1 durch seine Agonisten neuroprotektive Wirkungen hervorrufen kann. Um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen aufzuklären, wollten wir als Nächstes untersuchen, ob Risikofaktoren im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit (umweltbedingt und/oder genetisch) die Expression von Nurr1 und anderen wichtigen Transkriptionsfaktoren von mDANs verändern können. Wir untersuchten zunächst die Proteinspiegel in MN9D-Zellen nach Exposition gegenüber MPP+ (0,5 mM). Bemerkenswerterweise waren die Nurr1-Proteinspiegel ab 8 Stunden deutlich herunterreguliert und sanken nach 24-stündiger Exposition um mehr als 70 % (ergänzende Abbildung 4a, b). Im deutlichen Gegensatz dazu hatte die Exposition gegenüber MPP+ keinen Einfluss auf die Expression anderer Schlüsselfaktoren (z. B. Pitx3, FoxA2 und Lmx1A) und des β-Actin-Proteins. Darüber hinaus führte die Überexpression von Wildtyp- (αSynWT) oder mutiertem α-Synuclein (αSynA53T) ebenfalls zu einer signifikanten Herunterregulierung des Nurr1-Proteins, nicht jedoch anderer Faktoren (ergänzende Abbildung 4c – e). Die mutierte Form (αSynA53T) zeigte größere Wirkungen als der Wildtyp. Diese Daten stehen im Einklang mit früheren Studien, die berichteten, dass die Nurr1-Expression bei PD-Patienten18,19,20,39 sowie in αSyn-überexprimierenden PD-Tiermodellen40,41 signifikant reduziert ist. Wir fanden auch heraus, dass CQ- und 4A7C-301-Behandlungen die Nurr1-Proteinspiegel gegenüber der Überexpression von MPP + und αSynWT signifikant wiederherstellten, die Nurr1-Werte jedoch nur durch 4A7C-301 gegen die Überexpression von αSynA53T aufrechterhalten wurden (ergänzende Abbildung 4g, i). Als nächstes untersuchten wir, ob CQ und 4A7C-301 die Nurr1-Genexpression regulieren/erhöhen. Die Behandlung mit MPP+ oder die Überexpression von Wildtyp- und mutiertem αSyn reduzierte die Nurr1-mRNA-Expression in MN9D-Zellen erheblich. Die Behandlung mit CQ oder 4A7C-301 veränderte jedoch die Nurr1-mRNA-Spiegel nicht (ergänzende Abbildung 4f, h), obwohl die Proteinspiegel signifikant wiederhergestellt wurden (ergänzende Abbildung 4g, i). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass CQ und 4A7C-301 die Spiegel des Nurr1-Proteins auf der posttranskriptionellen Ebene regulieren, ohne die mRNA-Spiegel zu verändern, wahrscheinlich durch die Erhöhung der Stabilität des Nurr1-Proteins, das anfällig für MPP+- oder αSyn-Toxizität ist und durch diese herunterreguliert wird. Wir haben außerdem die Auswirkungen von CQ und 4A7C-301 auf die dopaminerge Genexpression, einschließlich TH, Dopamintransporter (DAT), aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase (AADC), vesikulärer Monoamintransporter 2 (VMAT2) und c-Ret, in zwei in vitro dopaminergen Genen bestimmt Systeme, MN9D-Zelllinie und primäre ventrale mesenzephale (VM) Zellen der Maus. CQ/4A7C-301 rettete die Expression aller dieser getesteten Gene, die durch MPP+- oder 6-OHDA-Behandlung verringert wurden, signifikant, und 4A7C-301 zeigte ähnliche Wirkungen bei 20–40-mal niedrigeren Konzentrationen als CQ (ergänzende Abbildung 5). Als Nurr1 ausgeschaltet wurde, sank nicht nur die Basalexpression dieser Gene um mehr als 50 %, sondern auch die Schutzwirkung von CQ und 4A7C-301 verschwand vollständig (ergänzende Abbildung 5h, i).

Um die neuroprotektiven Wirkungen von CQ und 4A7C-301 in einem physiologischeren Kontext weiter zu untersuchen, verwendeten wir ein primäres Ratten-VM-Neuron-Glia-Kokultursystem, das es uns ermöglichte, das Überleben von mDANs sowie die Neuroinflammation durch Mikroglia-Aktivierung zu untersuchen. Wie in Abb. 2c–g gezeigt, induzierte die Behandlung mit MPP+ (0,5 µM) oder LPS (15 ng/ml) deutlich den Tod von mDAN-Zellen (>60 %), zusammen mit der Aktivierung des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba-1). positive Mikroglia. Eine Vorbehandlung mit CQ oder 4A7C-301 führte dosisabhängig zu einer deutlichen Rettung der mDANs. 4A7C-301 zeigte die maximale Wirkung bei 500 nM, was einer 40-mal niedrigeren Konzentration entspricht, als für einen ähnlichen CQ-Effekt erforderlich ist (20 µM) (Abb. 2d, e). Darüber hinaus unterdrückte 4A7C-301 die Mikroglia-Aktivierung gegen LPS bei 500 nM optimal, was 40-mal niedriger als CQ ist (Abb. 2f, g). Um herauszufinden, ob CQ und 4A7C-301 die Expression entzündungsfördernder Gene in Mikroglia (in Abwesenheit von mDANs) unterdrücken können, verwendeten wir LPS, um eine Entzündung in aus Mikroglia der Maus stammenden BV2-Zellen zu induzieren, was zu einer dramatischen Induktion des Tumors führte. Nekrosefaktor-α (TNFα)-Gen, das durch CQ und 4A7C-301 stark unterdrückt wurde (ergänzende Abbildung 6). In diesem Assay zeigte 4A7C-301 eine viel höhere Wirksamkeit als CQ, mit EC50 von ~1 bzw. ~100 nM. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass 4A7C-301 mDANs vor MPP+- und LPS-induziertem Zelltod schützt und gleichzeitig die Neuroinflammation bei beiden Effekten deutlich stärker unterdrückt als CQ.

Es ist bekannt, dass CQ (und AQ) die Autophagie hemmen, indem sie die reife Autophagosom-Lysosom-Fusion zur Bildung von Autophagolysosomen (APL) im späten Stadium des Autophagieprozesses stören42,43,44. Da eine fehlregulierte Autophagie mit der PD-Pathologie in Zusammenhang steht7, haben wir festgestellt, ob 4A7C-301 auch die Autophagie beeinflusst. Wir haben zunächst HeLa-Zellen untersucht, die häufig zur Untersuchung der Autophagieregulation eingesetzt werden. Zu diesem Zweck verwendeten wir den Tandem-mRFP-GFP-LC3-Fluoreszenztest, bei dem GFP, aber nicht mRFP, in sauren Lysosomen abgebaut wird. Unter Hungerbedingungen mit EBSS-Medium wurde die Autophagie-Induktion durch eine erhöhte Anzahl sowohl gelber (mRFP+/GFP+) als auch roter (mRFP+/GFP-) Punkte nachgewiesen, die die Autophagosomen- bzw. APL-Bildung darstellen. Wie erwartet hemmte die Inkubation mit einem starken lysosomalen Protonenpumpenhemmer, Bafilomycin A1 (BafA1), den letzten Schritt der Autophagie vollständig, was durch die Zunahme der gelben Punkte, jedoch nicht der roten Punkte im Vergleich zur EBSS-Kontrollbedingung gezeigt wird (ergänzende Abbildung 7a). , B). Die CQ-Behandlung hemmte die APL-Bildung signifikant, was durch einen geringeren Prozentsatz an roten Punkten unter den gesamten LC3-Punkten (21,7 %) im Vergleich zu dem der EBSS-Erkrankung (62,0 %) angezeigt wird. Im deutlichen Gegensatz dazu hemmte die Behandlung mit 4A7C-301 die APL-Bildung nicht, wie 63,9 % der roten Punkte unter den gesamten LC3-Punkten zeigen. Als wir diesen Test in N27-A-Zellen durchführten, beobachteten wir ein identisches Muster wie in HeLa-Zellen und zeigten, dass CQ, nicht jedoch 4A7C-301, den Autophagieprozess hemmt (Abb. 3a, b). Da CQ bekanntermaßen den lysosomalen Säuregehalt beeinflusst46, haben wir seine Wirkung auf den lysosomalen pH-Wert untersucht. BafA1 und CQ, jedoch nicht 4A7C-301, erhöhten den lysosomalen pH-Wert sowohl in HeLa- (Ergänzende Abb. 7c, d) als auch in N27-A-Zellen (Abb. 3c, d) signifikant, was mögliche Mechanismen liefert, die ihren unterschiedlichen Auswirkungen auf die Autophagie zugrunde liegen. Wir haben den autophagischen Fluss weiter durch Western Blot stadienspezifischer Autophagiemarker in HeLa-Zellen analysiert. Die Expressionsänderungen von LC3B-II und p62 zeigten, dass die Autophagie eingeleitet wurde, in Gegenwart von BafA1 und CQ jedoch nicht beendet wurde (ergänzende Abbildung 7e – g). Im Gegensatz dazu wurde die Autophagie in Gegenwart von 4A7C-301 abgeschlossen, was durch einen verringerten p62-Spiegel belegt wurde (ergänzende Abbildung 7g). Wir analysierten auch den autophagischen Fluss in N27-A-Zellen mit oder ohne Verabreichung von MPP+ (1 mM). Wie in HeLa-Zellen fand die Autophagie in Gegenwart von 4A7C-301 statt, jedoch nicht in Gegenwart von BafA1 oder CQ (Abb. 3e – g). Bei der Verabreichung von MPP+ wurde die Autophagie gestört, was durch die Akkumulation von LC3B-II und konsistente p62-Spiegel im Spätstadium gezeigt wurde. Interessanterweise stellte die Behandlung mit 4A7C-301 die Autophagie in Gegenwart von MPP+ in N27-A-Zellen signifikant wieder her, was zu einem erfolgreichen p62-Abbau führte (Abb. 3g). Obwohl 4A7C-301 in allen Tests seine maximale Wirkung bei ≤ 1 µM zeigte, hemmte es die Autophagie nicht, selbst wenn zehnmal höhere Konzentrationen verwendet wurden (ergänzende Abbildung 7h – j).

a, b Assay zur Bildung von Autophagolysosomen (APL) in N27-A-Zellen. a Tandem-mRFP-GFP-LC3-Fluoreszenzbilder zur APL-Detektion. Maßstabsbalken, 20 µm. b Die Anzahl der gelben LC3-Punkte und roten LC3-Punkte pro Zelle wurde aus 10 zufälligen Zellen in jeder Vertiefung aus dreifacher Ausfertigung für jede Bedingung gezählt (insgesamt 30 Zellen pro Gruppe). Zweiseitiger ungepaarter t-Test. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM c, d Lysosomaler pH-Nachweis in N27-A-Zellen. c LysoSensor™ Gelb/Blau DND-160 Fluoreszenzbilder. Maßstabsbalken, 20 µm. d Quantifizierung aus 5 zufälligen Zellen in jeder Vertiefung aus dreifacher Ausfertigung für jede Behandlungsgruppe (insgesamt 15 Zellen pro Gruppe). Zweiseitiger ungepaarter t-Test. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwert ± SEM-E–G-Western-Blot-Analysen für den autophagischen Fluss in N27-A-Zellen. Expression der autophagischen Flussmarker LC3B und p62 (e) und Quantifizierung ihrer Expressionsniveaus (f, g). *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, ####P < 0,0001 im Vergleich zu EBSS, Zwei-Wege-ANOVA, Bonferronis Mehrfachvergleichen; n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM

Die oben genannten Ergebnisse veranlassten uns zu der Hypothese, dass 4A7C-301 in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit starke krankheitsmodifizierende Wirkungen entfalten könnte. Um dieses Problem anzugehen, verwendeten wir zwei Mausmodelle, eines auf der Basis eines Neurotoxins (MPTP) und das andere auf einem genetischen Faktor (αSyn). Zuerst verwendeten wir ein subchronisches MPTP-induziertes (30 mg/kg/Tag, 5 Tage) männliches Mausmodell durch Verabreichung von CQ (40 mg/kg/Tag), 4A7C-301 (5 mg/kg/Tag) oder L-DOPA (50 mg/kg/Tag) für 16 Tage (Abb. 4a). MPTP-behandelte Mäuse zeigten im Vergleich zur Vehikelkontrollgruppe (VEH) in allen drei Tests (Rotarod-, Pol- und Zylindertests) eine eingeschränkte motorische Funktion, die durch alle drei Medikamente mit ähnlicher Wirksamkeit deutlich verbessert wurde, obwohl 4A7C-301 etwa verwendet wurde ein Zehntel der Konzentrationen von CQ und L-DOPA (Abb. 4b – d). Da eine olfaktorische Dysfunktion ein häufiges Prodrom von PD47 ist, haben wir untersucht, ob diese Verbindungen diese nichtmotorische Dysfunktion verbessern können. Im olfaktorischen Diskriminierungstest blieben Mäuse mit MPTP-Läsionen kürzer in der alten Einstreu, was auf eine Beeinträchtigung bei der Unterscheidung zwischen vertrauten und unbekannten Gerüchen hindeutet. CQ und 4A7C-301, jedoch nicht L-DOPA, stellten den Geruchssinn deutlich wieder her (Abb. 4e). Als nächstes untersuchten wir jeden zweiten oder dritten Tag die Werte für abnormale unwillkürliche Bewegungen (AIMs), einschließlich axialer, Gliedmaßen- und orolingualer Dyskinesie, um dyskinesieähnliches Verhalten zu überwachen. In Übereinstimmung mit der Literatur48 löste die L-DOPA-Behandlung ab 7 Tagen nach der Injektion schwere AIMs aus (Abb. 4f und ergänzende Abb. 8f, g). Im Gegensatz dazu induzierte die Behandlung mit CQ oder 4A7C-301 keine nachweisbaren AIMs. Um zu testen, ob diese Verhaltensverbesserungen auf Neuroprotektion zurückzuführen sind, haben wir immunhistochemische Daten stereologisch analysiert und beobachtet, dass TH+-Fasern im Striatum (STR) und TH+-DA-Neuronen sowie NeuN+-Neuronen in der Substantia nigra (SN) nach CQ und 4A7C-301 signifikant erhalten blieben Behandlung, jedoch nicht mit L-DOPA im Vergleich zur reinen MPTP-Gruppe (Abb. 4g – k). Wir untersuchten auch, ob die Neuroinflammation beeinflusst wurde, indem wir Iba-1 als aktivierten Mikroglia-Marker verwendeten. Wie in Abb. 4l–n gezeigt, erhöhte die MPTP-Behandlung die Iba-1+-Mikroglia sowohl im STR als auch im SN signifikant. Die Behandlung mit CQ und 4A7C-301, jedoch nicht mit L-DOPA, reduzierte die Iba-1+-Mikroglia in beiden Regionen deutlich. Wir haben weiter getestet, ob die DA-Werte durch die Behandlung mit CQ und 4A7C-301 wiederhergestellt wurden. Die Behandlung mit 4A7C-301 stellte die DA-Werte sowohl im SN als auch im STR signifikant wieder her, während dies bei CQ nur im SN der Fall war (ergänzende Abbildung 10a – c). Schließlich wiederholten wir diese Verhaltenstests in einem chronischen Stadium am Tag 14–15 und beobachteten ähnliche Verhaltensmuster bei Geruchs- und AIM-Tests (ergänzende Abbildung 8b – e). Es blieben jedoch nur Defizite im Rotarod-Motor bestehen, während bei Pol- und Zylindertests die Defizite verschwanden, was auf ein gewisses Maß an spontaner Erholung schließen lässt49,50,51. Zusammengenommen zeigte das MPTP-geschädigte Mausmodell, dass 4A7C-301 sowohl motorische als auch nichtmotorische Defizite mit verringerter Neuroinflammation und ohne dyskinesieähnliche Nebenwirkungen verbessert. Allerdings weist die MPTP-Läsionierung als PD-Modell Einschränkungen auf, einschließlich bestimmter Grade der spontanen Erholung. Daher verwendeten wir als nächstes das AAV2-αSyn-basierte Mausmodell, das die progressiven und pathophysiologischen Merkmale der menschlichen PD-Pathogenese genauer nachahmt.

a Schematische Darstellung der Verabreichung von L-DOPA, CQ und 4A7C-301 an MPTP-induzierte männliche Mäuse. b–d Verhaltenstests im Zusammenhang mit motorischer Koordination und spontaner Bewegung, bewertet mit Rotarod (b), Stangentest (c) und Zylindertest (d). Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Verhaltenstest bei olfaktorischer Dysfunktion, bewertet mittels olfaktorischem Diskriminierungstest. Links, Verweildauer zwischen neuer und alter Bettwäsche. Zweifaktorielle ANOVA, Mehrfachvergleiche von Bonferroni. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung, Geschwindigkeit während der Sitzung. Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test. Bei den Daten handelt es sich um einen Mittelwert ± Standardabweichung des globalen AIMs-Scores, der durch Multiplikation der Basis- und Amplituden-AIMs-Scores berechnet wird (ergänzende Abbildung 8f, g). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung g–k. Immunhistochemische Analysen von TH+-DA-Neuronen (g–j) und NeuN+-Neuronen (I, k) im STR (g, h) und SNpc (i–k). Maßstabsbalken, 500 µm. Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM l–n. Immunhistochemische Analysen von Iba-1+-Mikroglia durch Zählung in STR (m) und SNpc (n). Maßstabsbalken, 500 µm. Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test. Die Daten sind Mittelwerte ± Sem

Wir injizierten Adeno-assoziiertes Virus 2 (AAV2), das Wildtyp (αSynWT) oder mutiertes αSyn (αSynA53T) exprimiert, einseitig in die SN (linke Hemisphäre) männlicher C57BL/6 J-Mäuse. CQ (40 mg/kg/Tag) oder 4A7C-301 (5 mg/kg/Tag) wurde von der 4. bis 8. Woche nach der Operation (ip) verabreicht (Abb. 5a). Sowohl αSynWT- als auch αSynA53T-induzierte Mäuse zeigten einen deutlichen Verlust von mDANs (Abb. 5b) und motorische Defizite in Zylinder- (Abb. 5c, d), Rotarod- (ergänzende Abb. 9a, c) und Poltests (ergänzende Abb. 9b, d) ab der 6. Woche nach der Operation, mit höherem Schweregrad bei αSynA53T-induzierten Mäusen. Die CQ-Behandlung führte zu einer teilweisen Wiederherstellung der Aufzucht (Abb. 5c), der Sturzlatenz (ergänzende Abb. 9a) und der Zeit zum Überqueren der Stange (ergänzende Abb. 9b). Die Behandlung mit 4A7C-301 verbesserte motorische Defizite mit größerer Wirksamkeit als CQ sowohl bei αSynWT- als auch bei αSynA53T-induzierten Mäusen in allen untersuchten Tests (Abb. 5d, ergänzende Abb. 9c, d). Im olfaktorischen Diskriminierungstest zeigten sowohl αSynWT- als auch αSynA53T-induzierte Mäuse ab der 4. Woche nach der Operation eine olfaktorische Dysfunktion (Abb. 5e, f und ergänzende Abb. 9e – g). Sowohl CQ- als auch 4A7C-301-Behandlungen retteten die Riechstörung bei αSynWT-Mäusen 6 und 8 Wochen nach der Operation. Allerdings konnte nur 4A7C-301 die olfaktorische Dysfunktion bei αSynA53T-Mäusen signifikant umkehren, während es zwischen den Gruppen keinen signifikanten Unterschied in der Geschwindigkeit/Mobilität gab (Abb. 5f und ergänzende Abb. 9g). Nach Verhaltenstests töteten wir Mäuse und charakterisierten die Behandlungseffekte auf ihr Gehirn durch immunhistochemische Analysen. Die stereologische Quantifizierung ergab, dass sowohl CQ- als auch 4A7C-301-Behandlungen den Verlust von TH+- und NeuN+-Neuronen und TH+-Fasern im SN bzw. im STR von αSynWT-Mäusen teilweise verhinderten (Abb. 5g – k). Allerdings konnte nur die Behandlung mit 4A7C-301 den Verlust von TH+- und NeuN+-Neuronen und -Fasern bei αSynA53T-Mäusen signifikant verhindern. In Übereinstimmung mit diesen Daten erhöhten sowohl CQ ​​als auch 4A7C-301 die DA-Spiegel im SN und STR von αSynWT-Mäusen signifikant, während nur 4A7C-301 die DA-Spiegel von αSynA53T-Mäusen erhöhte (ergänzende Abbildung 10d – f). Wir haben die Immunreaktivität gegen phosphoryliertes αSyn am Serin-129-Rest (αSynS129) stereologisch bewertet, was mit der Erleichterung der LB-Bildung und der beschleunigten Neurodegeneration bei PD53 verbunden ist. Wie in Abb. 5l, m gezeigt, wurde αSynS129 im SN von αSynWT-Mäusen und häufiger in αSynA53T-Mäusen nachgewiesen. Während CQ- und 4A7C-301-Behandlungen αSynS129 bei αSynWT-Mäusen signifikant verringerten, reduzierte nur 4A7C-301 es signifikant bei αSynA53T-Mäusen, was darauf hindeutet, dass 4A7C-301 pathogene Phänotypen in diesen Tiermodellen wirksam linderte und zwar mit einer größeren Wirksamkeit als CQ.

a Schematische Darstellung der Verabreichung von CQ und 4A7C-301 an männliche Mäuse, denen AAV-αSyn injiziert wurde. b Repräsentative TH- (rot) und GFP-Immunfluoreszenzbilder (grün) aus zwei unabhängigen Experimenten im SNpc von AAV-αSynWT- oder -αSynA53T-injizierten Mäusen. Maßstabsbalken, 500 µm. c, d Zylindertests mit CQ (c) oder 4A7C-301 (d) behandelter Gruppe. †††P < 0,001, ††††P < 0,001 im Vergleich zwischen GV und WV; *P < 0,05, ****P < 0,0001 im Vergleich zwischen GV und AV; #P < 0,05 im Vergleich zu WV zu WC oder W301; §§§§P < 0,0001 im Vergleich zu AV zu AC oder A301. Zweifaktorielle ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleiche; n = 8 pro Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von GV, GFP + VEH; WV, αSynWT + VEH; AV, αSynA53T + VEH; WC, αSynWT + CQ; AC, αSynA53T + CQ; W301, αSynWT + 4A7C-301; A301, αSynA53T + 4A7C-301. e, f Olfaktorischer Diskriminierungstest, durchgeführt 8 Wochen nach der Operation. e Verweildauer zwischen neuer und alter Bettwäsche. Zweifaktorielle ANOVA, Mehrfachvergleiche von Bonferroni. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung der Geschwindigkeit während der Sitzung. ns, nicht signifikant (P > 0,05), einfaktorielle ANOVA. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM n = 8 pro Gruppe. g, h Immunhistochemische Analysen von TH+-Neuronen mittels Densitometrie im STR. Maßstabsbalken, 500 µm. Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test; n = 5 pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± sem i–k immunhistochemische Analysen von TH+ DA-Neuronen (I, j) und NeuN+ Neuronen (I, k) im SNpc. Maßstabsbalken, 500 µm. Einfaktorielle ANOVA, Tukey-Post-hoc-Test; j, n = 5 pro Gruppe; k, n = 4 pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Repräsentative pS129-Immunhistochemie im SNpc. Maßstabsbalken, 250 µm. m, Quantifizierung von pS129 αSyn+-Zellen durch Zählung. Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test; n = 5 pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwert ± Sem n-Western-Blot-Analysen von humanem αSyn im SNpc von AAV-αSyn-injizierten Mäusen. Die Werte werden als relativer Ausdruck im Vergleich zur kontralateralen Seite ausgedrückt. Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test; n = 3 pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM o–q. Immunhistochemische Analysen von Iba-1+-Mikroglia durch Zählung in STR (p) und SNpc (q). Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test; n = 5 pro Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardmaßstabsbalken, 250 µm.

Trotz zahlreicher Studien zur Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit stehen bisher weder klare Mechanismen zur Verfügung, die dem Verlust von mDANs im SN zugrunde liegen, noch geeignete krankheitsmodifizierende Behandlungen. Obwohl allgemein bekannt ist, dass Nurr1 die Entwicklung, Aufrechterhaltung und den Schutz von mDANs entscheidend reguliert, ist relativ undokumentiert, ob und wie es an der Parkinson-Krankheitspathogenese beteiligt ist. Um dieses Problem anzugehen, haben wir getestet, ob umweltbedingte (z. B. MPP+) und/oder genetische (z. B. αSyn) Risikofaktoren für Parkinson die Expression und Funktion von Nurr1 beeinträchtigen. Unsere Daten zeigten, dass sowohl die MPP+-Behandlung als auch die αSyn-Überexpression die Nurr1-Expression stark herunterregulieren. Im Gegensatz dazu hatten diese Behandlungen keinen Einfluss auf die Expression anderer wichtiger Transkriptionsfaktoren von mDANs (z. B. Pitx3, FoxA2 und Lmx1A) oder β-Actin. Die Überexpression pathogener Formen von αSyn führte zu einer stärkeren Reduzierung der Nurr1-Spiegel als beim Wildtyp. Diese Daten deuten darauf hin, dass Nurr1 als Gatekeeper zwar für mDANs von entscheidender Bedeutung ist, seine anhaltende Exposition gegenüber Parkinson-Risikofaktoren (sowohl genetisch als auch umweltbedingt) seine Expression und/oder Funktion beeinträchtigt und zur Degeneration von mDANs beiträgt. Da die Nurr1-Spiegel in postmortalen Studien an gealterten Gehirnen herunterreguliert werden20, erklärt unser Modell nicht nur den altersabhängigen Verlust von mDANs, sondern auch den durch umweltbedingte und genetische Faktoren verursachten Verlust. Diese Schlussfolgerung steht im Einklang mit früheren postmortalen Studien am Menschen und an Tiermodellen und legt darüber hinaus die Möglichkeit nahe, dass eine beeinträchtigte Expression/Funktion von Nurr1 der Degeneration von mDANs sowohl bei familiärer als auch bei sporadischer Parkinson-Krankheit zugrunde liegen könnte, was einen potenziellen einheitlichen Mechanismus der Parkinson-Krankheitspathogenese darstellt.

Um unsere Hypothese zu klären, dass Nurr1 ein vielversprechendes molekulares Ziel für die Intervention bei der Parkinson-Krankheit ist, haben wir zuvor Hochdurchsatz-Screeningsysteme zum Nachweis von Nurr1-Aktivatoren eingerichtet und drei Verbindungen (d. h. CQ, AQ und Glafenin) identifiziert, die ein identisches Gerüst 4A7C haben. Basierend auf diesen Erkenntnissen stellten wir und andere die Hypothese auf, dass 4A7C ein SAR für die Bindung und Aktivierung von Nurr124,54 darstellt. Mithilfe dieser mutmaßlichen SAR (4A7C) haben wir >570 Derivate von CQ generiert und charakterisiert, was zur Identifizierung eines optimierten Agonisten, 4A7C-301, führte. Hier haben wir 4A7C-301 und CQ auf ihre Auswirkungen auf verschiedene In-vitro- und In-vivo-Modelle der Parkinson-Krankheit getestet und schlagen vor, dass 4A7C-301 eine krankheitsmodifizierende Behandlung der Parkinson-Krankheit darstellen könnte, wie die folgenden Ergebnisse belegen.

Erstens zeigte 4A7C-301 im Vergleich zu CQ oder AQ eine etwa 20-fach höhere Bindungsaffinität und seine Aktivierung der Nurr1-Funktion erfordert das Vorhandensein spezifischer Aminosäuren innerhalb der Nurr1-LBD. Darüber hinaus steigerte 4A7C-301 die Transkriptionsaktivität von Nurr1 erheblich und zeigte neuroprotektive Wirkungen für mDANs, die Neurotoxinen (z. B. MPP+ und LPS) ausgesetzt waren, mit größerer Wirksamkeit als CQ (>20-fach), was auf eine mechanismusbasierte Nurr1-Aktivierung schließen lässt. Unsere Daten zeigten, dass 4A7C-301 sowohl die Transkriptionsaktivatorfunktion von Nurr1 (z. B. Expression mDAN-spezifischer Gene und Produktion von DA in mDANs) als auch seine Repressorfunktion (z. B. Unterdrückung entzündungsfördernder Zytokin-Gene und Mikroglia-Aktivierung) gleichermaßen wirksam steigert höhere Effizienz als CQ (>20-fach). Zweitens beobachteten wir, dass die Behandlung mit CQ oder 4A7C-301 die Nurr1-Proteinspiegel, die durch MPP+-Behandlung und αSyn-Überexpression reduziert wurden, ohne Veränderung ihrer mRNA-Spiegel signifikant wiederherstellte, was stark darauf hindeutet, dass Nurr1-Liganden die Nurr1-Proteinspiegel nach der Transkription regulieren können Ebenen. Daher spekulieren wir, dass Nurr1-Liganden die Stabilität des Nurr1-Proteins regulieren könnten, das anfällig ist und durch Umwelttoxizität (MPP+) und/oder genetische Toxizität (αSyn) herunterreguliert wird, und dass 4A7C-301 (und in geringerem Maße CQ) neuroprotektive Wirkungen zeigt zwei unterschiedliche Mechanismen: (1) Aktivierung der Transkriptionsfunktion von Nurr1 und (2) Stabilisierung und Wiederherstellung der Nurr1-Proteinspiegel. Drittens haben wir unter Verwendung verschiedener Zellmodelle herausgefunden, dass 4A7C-301 mDA-Zellen über mehrere nachgeschaltete Wege im Wesentlichen schützt, z. B. durch Reduzierung von oxidativem Stress und Zytotoxizität, Schutz der Mitochondrienfunktion und Induktion der mDAN-spezifischen Genexpression, einschließlich GDNF-Rezeptor c-ret und Reduzierung der Neuroinflammation. Darüber hinaus hemmt CQ die Autophagie, 4A7C-301 jedoch nicht. Tatsächlich stellt 4A7C-301 die durch die MPP+-Behandlung beeinträchtigten zellulären Autophagiefunktionen wieder her. Da CQ ein Prototyp eines Autophagie-Inhibitors ist und bekanntermaßen die Ablagerung der αSyn-Pathologie beschleunigt55, ist die Autophagie-Hemmung von CQ und der Autophagie-Schutz von 4A7C-301 ein wichtiger Unterschied. Wir spekulieren, dass die gleiche Kernstruktur es CQ und 4A7C-301 ermöglicht, Nurr1 (im Zusammenhang mit dem mutmaßlichen SAR) zu binden und in den meisten Tests ähnliche Aktivitäten zu zeigen, während ihre unterschiedlichen Seitenkettenstrukturen höchstwahrscheinlich ihren unterschiedlichen Auswirkungen auf die Autophagie zugrunde liegen. Dies wird dadurch gestützt, dass CQ und BafA1, beide bekannte Autophagie-Inhibitoren, den lysosomalen pH-Wert signifikant erhöhten, während 4A7C-301 keine Wirkung hatte, was auf mögliche Mechanismen hindeutet, die den unterschiedlichen Wirkungen von CQ/4A7C-301 auf die Autophagie zugrunde liegen. Viertens stellte 4A7C-301 in MPTP- und αSyn-induzierten Mausmodellen motorische Defizite und nichtmotorisches Verhalten (z. B. olfaktorische Defekte) deutlich wieder her, ohne dass dyskinesieähnliche Nebenwirkungen auftraten. Eine wesentliche Einschränkung aktueller pharmakologischer Behandlungen der Parkinson-Krankheit besteht darin, dass sie bei vielen Patienten letztendlich Nebenwirkungen wie Dyskinesien hervorrufen8,9. Wie erwartet induzierte die Verabreichung von L-DOPA bei MPTP-induzierten Mäusen ein robustes dyskinesieähnliches Verhalten. Im krassen Gegensatz dazu löste die Behandlung mit 4A7C-301 oder CQ trotz vergleichbarer Verbesserungen bei motorischen Tests kein erkennbares dyskinesieähnliches Verhalten aus. Ein möglicher Wirkungsmechanismus von 4A7C-301/CQ im MPTP-Modell besteht darin, dass sie den Metabolismus von MPTP zu MPP+ beeinflussen können. Diese Erklärung ist jedoch unwahrscheinlich, da 4A7C-301/CQ 6 Stunden nach der MPTP-Injektion verabreicht wurde, dem Zeitpunkt, an dem MPTP sowohl im Striatum als auch in SN56 vollständig zu MPP+ metabolisiert wird.

Ein weiteres interessantes Ergebnis dieser Studie ist das beobachtete olfaktorische Defizit sowohl in MPTP-induzierten als auch in αSyn-Überexpressionsmodellen und dass 4A7C-301 (und in geringerem Maße CQ) dieses Defizit deutlich behoben hat, was die Möglichkeit nahelegt, dass Nurr1-Agonisten zumindest einige verbessern könnten auch der nichtmotorischen Defizite der Parkinson-Krankheit. In jüngsten Studien an Tiermodellen mit αSyn-Überexpression57 oder Injektion vorgeformter αSyn-Fibrillen58 wurde auch eine olfaktorische Dysfunktion beobachtet. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die der olfaktorischen Dysfunktion in diesen Tiermodellen und ihrer Verbesserung durch Nurr1-Agonisten zugrunde liegen, derzeit noch unklar und warten auf weitere Untersuchungen. Schließlich zeigten unsere Daten, dass Nurr1 und αSyn sich sowohl in vitro als auch in vivo gegenseitig regulieren, was maßgeblich von 4A7C-301 beeinflusst wird. Während eine Überexpression von αSyn Nurr1 stark herunterreguliert, wurde umgekehrt die Akkumulation von αSyn durch 4A7C-301 deutlich verringert, selbst wenn seine pathogene Form (αSynS129) überexprimiert wurde.

Trotz dieser vielversprechenden Daten muss beachtet werden, dass 4A7C-301 Einschränkungen aufweist. Beispielsweise ist die Wirkungsweise, durch die 4A7C-301 die Transkriptionsfunktion und/oder Expression von Nurr1 reguliert, unklar. Dieses Problem ist von entscheidender Bedeutung, da Nurr1 in verschiedenen zellulären Kontexten sowohl als Transkriptionsaktivator als auch als Repressor fungieren kann und 4A7C-301 beide Funktionen beeinflusst. Darüber hinaus müssen die potenziellen Off-Target-Wirkungen und Toxizitäten von 4A7C-301 bei der Bewertung seines therapeutischen Potenzials umfassend berücksichtigt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zwar weitere Studien erforderlich sind, wir jedoch zu dem Schluss kommen, dass Nurr1 ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuroprotektiver Therapeutika darstellt. Optimierte zielgerichtete Agonisten wie 4A7C-301 oder seine analogen Verbindungen könnten das Potenzial für mechanismusbasierte, krankheitsmodifizierende Behandlungen sowohl für sporadische als auch familiäre Parkinson-Krankheit haben.

Alle experimentellen Verfahren folgten den Richtlinien des National Institute of Health und alle Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des McLean Hospital genehmigt (Protokoll-Nr.: 2015N000002).

Alle in der Synthese verwendeten Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich bezogen und ohne weitere Modifikationen verwendet. Mithilfe von Dünnschichtchromatographie wurde der Fortschritt der Reaktionen unter Verwendung vorbeschichteter TLC-Platten (E. Merck Kieselgel 60 F254) überwacht, wobei die Flecken durch Joddämpfe/UV-Lampe sichtbar gemacht wurden. Die Verbindungen wurden über eine Kieselgelsäule (60–120 Mesh) gereinigt oder mit geeigneten Lösungsmitteln umkristallisiert. Lösungsmittel wurden vor der Verwendung zu Reinigungszwecken destilliert. Die Schmelzpunkte wurden mit einem automatischen ERS-Schmelzpunktgerät aufgezeichnet und sind nicht korrigiert. IR-Spektren wurden mit einem Perkin-Elmer- und einem Bruker-FT-IR aufgezeichnet und die Werte werden als λmax cm−1 ausgedrückt. Massenspektraldaten wurden mit einem Jeol-AccuTOF JMS-T100LC und einem Micromass LCT-Massenspektrometer/Datensystem aufgezeichnet. Die 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren wurden mit einem Jeol Spectrospin-Spektrometer bei 400 MHz bzw. 100 MHz unter Verwendung von TMS als internem Standard aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungswerte werden auf der δ-Skala aufgezeichnet und die Kopplungskonstanten (J) sind in Hz angegeben.

Eine Mischung aus 4,7-Dichlorchinolin (1, 10,0 g, 50,49 mmol) und Ethan-1,2-diamin (2a, 16,9 ml, 252,45 mmol) wurde 6 Stunden lang bei 120 °C gerührt (Schema 1). Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und mit eiskaltem Wasser versetzt. Der so erhaltene Feststoff wurde filtriert und mit überschüssigem Wasser gewaschen. Das Rohprodukt wurde unter Verwendung von Ethanol kristallisiert und als solches für den nächsten Schritt verwendet.

Zwischenprodukt 3 (5 g, 22,6 mmol) und Verbindung 4 (4,14 g, 22,6 mmol) wurden in einen Rundkolben mit 50 ml THF gegeben. Triethylamin (9,5 ml, 67,8 mmol) wurde tropfenweise in die obige Reaktionsmischung gegeben. Nach Abschluss der Zugabe wurde die Reaktionsmischung über Nacht bei 60 °C gerührt. Nach Abschluss der Reaktion, wie durch DC beobachtet, wurde die Reaktionsmischung in zerstoßenes Eis gegossen, um die Mischung der Rohverbindungen 5A und 5B auszufällen. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 5 % MeOH-CHCl3 als Elutionsmittel gereinigt, um 5 A (25 % Ausbeute, geringer Ausbeute) und 5B (53 % Ausbeute, Hauptausbeute) als die beiden Pyrimidin-Regioisomere 5 A und 5B zu ergeben.

Weißer Feststoff, Ausbeute: 25 %; Schmelzpunkt: 237–239 °C; IR (KBr, cm−1): 3262, 3113, 1549, 1445, 1234, 1128, 1097, 806; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 3,45–3,53 (m, 4H), 6,71 (d, J = 5,50 Hz, 1H), 6,90 (s, 1H), 7,39–7,46 (m, 2H ), 7,79 (d, J = 2,20 Hz, 1H), 8,19 (d, J = 9,07 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 5,77 Hz, 1H), 8,41 (d, J = 5,36 Hz, 1H); anal. berechnet für C15H12Cl3N5: C, 48,87; H, 3,28; N, 19.00; gefunden: C, 48,96; H, 3,30; N, 18,97; ESI-HRMS (m/z) berechnet für C15H13Cl3N5 (M + H)+: 368,0231, gefunden: 368,0237 (M + H)+, 370,0211 (MH + 2)+, 372,0178 (MH + 4)+.

Weißer Feststoff, Ausbeute: 53 %; Schmelzpunkt: 235–237 °C; IR (KBr, cm−1): 3348, 2940, 1566, 1447, 1358, 1271, 1120, 984, 804; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 3,45–3,60 (m, 4H), 6,54 (s, 1H), 6,70 (d, J = 5,36 Hz, 1H), 7,44–7,47 (m, 2H ), 7,79 (d, J = 1,92 Hz, 1H), 8,20 (d, J = 9,07 Hz, 1H), 8,37–8,43 (m, 2H); anal. berechnet für C15H12Cl3N5: C, 48,87; H, 3,28; N, 19.00; gefunden: C, 49,01; H, 3,30; N, 19.05; ESI-HRMS (m/z) berechnet für C15H13Cl3N5 (M + H)+: 368,0231, gefunden: 368,0242 (M + H)+, 370,0214 (MH + 2)+, 372,0181 (MH + 4)+.

Verbindung 5 A (200 mg, 0,54 mmol) und N-Ethylpiperazin (1,4 ml, 10,85 mmol) wurden in ein verschlossenes Röhrchen gegeben und die Reaktionsmischung 5 Stunden lang auf 110 °C erhitzt. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Mischung in eiskaltes Wasser gegossen. Der resultierende Niederschlag wurde filtriert, mit überschüssigem kaltem Wasser gewaschen, um das Amin zu entfernen, und getrocknet, um das Rohprodukt zu erhalten. Anschließend wurde es in Ethanol umkristallisiert, um das reine Produkt als cremefarbenen Feststoff zu erhalten. Ausbeute: 70 %; Schmelzpunkt: 88–90 °C; IR (KBr, cm-1): 3282, 2924, 2852, 1569, 1446, 1372, 1260, 1006, 798; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1,09 (t, J = 7,33 Hz, 6H), 2,40–2,51 (m, 12H), 3,38–3,39 (m, 2H), 3,60 (brs, 8H), 3,83–3,88 (m, 2H), 5,05 (t, J = 6,18 Hz, 1H), 5,22 (s, 1H), 6,26 (d, J = 5,50 Hz, 1H), 7,21 (dd, J = 8,93, 2,29 Hz , 1H), 7,31 (brs, 1H), 7,53 (d, J = 8,70 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 1,83 Hz, 1H), 8,46 (d, J = 5,50 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) 11,98, 39,62, 44,53, 47,43, 52,46, 52,59, 74,10, 98,12, 117,36, 122,61, 125,26, 128,27, 134,58, 14 9,04, 150,66, 152,05, 162,86, 164,70; anal. berechnet für C27H38ClN9: C, 61,87; H, 7,31; N, 24.05; gefunden: C, 62,01; H, 7,34; N, 23,99; ESI-HRMS (m/z) berechnet für C27H39ClN9 (M + H)+: 524,3017, gefunden: 524,3019 (M + H)+, 526,2991 (MH + 2)+; HPLC-Reinheit: 97,75.

SK-N-BE(2)C humanes Neuroblastom, BV2-Maus-Mikroglia (ATCC), HeLa- und MN9D-Zelllinien wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 100 U/ml Penicillin, kultiviert und 100 μg/ml Streptomycin. Die murine dopaminerge Zelllinie MN9D wurde freundlicherweise von Dr. Michael Zigmond und Juliann Jaumotte von der University of Pittsburgh. Die dopaminerge Zelllinie N27-A der Ratte wurde freundlicherweise von Dr. Curt Freed von der University of Colorado School of Medicine zur Verfügung gestellt. N27-A-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Lonza), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, kultiviert36. Für den Transaktivitätstest wurden SK-N-BE(2)C- und N27-A-Zelllinien mit pCMV-fNurr1, pGAL-Nurr1(LBD), pGAL-Nor1(LBD) oder pGAL-Nur77(LBD) und dem Reporterkonstrukt transfiziert ( p4xNL3-Luc für fNurr1 oder p8xUAS-Luc für LBD-Konstrukte). pRSV-β-gal wurde als interne Kontrolle co-transfiziert23. Die Zellen wurden in einem Lysepuffer (25 mM Trisphosphat (pH 7,8), 2 mM DTT, 2 mM DCTA (1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N′,N′-tetraessigsäure), 10 % Glycerin, und 1 % Triton Die Nurr1-Transaktivität wurde auf die β-Galactosidase-Aktivität normalisiert. Für MTT- und LDH-Assays wurden N27-A-Zellen über Nacht mit 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP+, 1 mM) in Abwesenheit oder Gegenwart von CQ oder 4A7C-301 behandelt. Zur Bestimmung der Nurr1-Stabilität wurden MN9D-Zellen 2, 4, 8, 16, 24 und 32 Stunden lang mit MPP+ (0,5 mM) inkubiert oder mit Lentivirus, das nur GFP exprimierte, oder αSyn (Wildtyp oder A53T) transduziert und dann geerntet 24 , 48 und 72 Stunden nach der Transduktion. Für den Autophagolysosomen (APL)-Bildungstest wurden HeLa- und N27-A-Zellen mit mRFP-GFP-LC3 (Addgene) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfiziert. Das Medium wurde 24 Stunden nach der Transfektion zur Autophagie-Induktion durch Hungermedium (Earle's Balanced Salt Solution; EBSS) ausgetauscht.

Proteinproben wurden aus Zellernten oder Hirngewebe in Homogenisierungspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich) mit 1 mM PMSF, Proteaseinhibitor, hergestellt Cocktail (Roche) und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich). Gleiche Mengen des mit der Bradford-Methode bestimmten Gesamtproteins wurden auf ein BoltTM 4–12 % Bis-Tris Plus-Gel (Invitrogen) geladen, gefolgt von der Übertragung auf PVDF-Membranen (Bio). -Rad). Nach der Blockierung in TBS-T-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 1 % Tween-20) mit 5 % Magermilch wurden die Membranen mit den folgenden Primärantikörpern inkubiert: Nurr1 (1 :1.000; hergestellt in unserem Labor59), LC3B (1:1.000; Cell Signaling, #2775), SQSTM1/p62 (1:1.000; Abcam, ab155686), αSyn (1:1.000; GeneTex, GTX112799), Pitx3 (1: 1.000; Invitrogen, 38-2850), FoxA2 (1:1.000; Abnova, H00003170-M12), Lmx1A (1:1.000; Millipore, AB10533) und β-Actin (1:5.000; Abcam, ab8227). Experimente wurden bestätigt durch Doppelmessungen derselben Probe. Die Quantifizierung der immunreaktiven Banden wurde mit der ImageJ-Software (NIH, Bethesda, MD, USA) durchgeführt und als relatives Verhältnis zu β-Actin ausgedrückt.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific) extrahiert und 100 ng RNA wurden einer cDNA-Synthese mit dem Invitrogen Superscript cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers unterzogen. qRT-PCR wurde unter Verwendung eines CFX Connect Real-Time-Systems (Bio-Rad) in einer Mischung mit einem Volumen von 20 μl durchgeführt, die 2X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 100 ng/μl Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 1 μl enthielt der cDNA-Probe. Die Genexpressionsniveaus wurden mit der 2∆∆CT-Methode (Ct des Zielgens – Ct der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)) quantifiziert. Die folgenden Primer wurden für die qRT-PCR verwendet: TH vorwärts: 5′-CAAGGTTCCCTGGTTCCCAA-3′ , rückwärts: 5′-CTTCAGCGTGGCGTATACCT-3′; DAT vorwärts: 5′-GTCACCAACGGTGGCATCTA-3′, rückwärts: 5′-TAGGCTCCATAGTGTGGGGG-3′; AADC vorwärts: 5′-CACGGCTAGCTCATACCCAG-3′, rückwärts: 5′-GCTCTTCCAGCCAAAAAGGC- 3′; VMAT2 vorwärts: 5′-ATGTGTTCCCGAAAGTGGCA-3′, rückwärts: 5′-AAGTTGGGAGCGATGAGTCC-3′; c-Ret vorwärts: 5′-TGCTGCTCTGGGAGATTGTG-3′, rückwärts: 5′-AACACTGGCCTCTTGTCTGG-3′; TNFα vorwärts: 5′-ATAGCTCCCAGAAAAGCAAGC-3′; rückwärts: 5′-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3′; GAPDH, vorwärts 5′-GAAGGTCGGTGTGAACGGAT-3′, rückwärts 5′-TTCCCATTCTCGGCCTTGAC-3′.

Nurr1-Mutanten wurden mit dem ortsspezifischen Mutagenese-Kit QuikChange ǁ XL (Agilent Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Mutagenesereaktionen wurden am Plasmid von Maus-Nurr1 durchgeführt, das in das pcDNA3.1-Rückgrat geklont wurde, und anschließend durch Sequenzierung verifiziert.

Sättigungs- und Konkurrenztests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt33. Für den Sättigungstest wurden 0,2 µM Nurr1-LBD und 125–10.000 nM [3H]-CQ in Bindungspuffer (20 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,2)) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Für den Konkurrenztest wurde eine feste Konzentration von [3H]-CQ (1.000 nM) mit seriellen Konzentrationen von unmarkierten Konkurrenten (CQ, 4A7C-301 oder Retinsäure (RA)) (10–4–105 nM) in Bindungspuffer bei inkubiert 4 °C über Nacht. Testmischungen wurden auf GF/B-Filter (Brandel Inc.) aufgetragen, um Nurr1-LBD-gebundene Liganden einzufangen. Die Daten geben den Durchschnitt von Dreifachversuchen an, und die Werte des Konkurrenztests wurden als Prozentsatz der Hemmung relativ zu 0 nM der Konkurrenz transformiert. Alle Diagramme und IC50-Werte wurden mit dem nichtlinearen Regressionsprogramm in GraphPad Prism Version 8.0.2 generiert.

Der TR-FRET-Assay wurde in PPI-Terbium (Tb)-Nachweispuffer (PerkinElmer) durchgeführt und enthielt 0,2 µM Nurr1-LBD, 0,5 µM fluoreszenzmarkiertes Hydroxy-CQ (HCQFluo; Proimaging) und serielle Konzentrationen von CQ, 4A7C-301 oder RA (10–4–106 nM). Kaninchen-Anti-Nurr1-Antikörper (3 nM; hergestellt in unserem Labor) und Anti-Kaninchen-IgG-Tb (1:400; Cisbio, 61PARTAF) wurden als Donorkomplex in die Testlösung einbezogen. Die Testlösungen wurden in eine OptiPlate™ mit 384 Vertiefungen (PerkinElmer) geladen. Nach 2-stündiger Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde das FRET-Signal durch Anregung bei 340 nm und Emission bei 520 nm für Fluorescein und 495 nm für Tb unter Verwendung eines VICTOR Nivo-Plattenlesegeräts (PerkinElmer) gemessen. Die Daten wurden mithilfe des nichtlinearen Regressionsprogramms in GraphPad Prism Version 8.0.2 angepasst.

Die Zellen wurden mit Nurr1 transfiziert, das zur Nurr1-Überexpression (OE) in den pcDNA3.1-Vektor23 subkloniert wurde. Für den Nurr1-Knockdown (KD) wurde spezifische Nurr1-shRNA (V3LHS_411033, TCTTCTGAACAACAAACTG; GE Dharmacon) ausgewählt und transfiziert. pcDNA und durcheinandergemischte shRNA (#RHS4346) wurden als Negativkontrolle für Nurr1 OE bzw. KD verwendet. Nurr1 OE oder KD durch Transfektion wurde durch Western Blot analysiert.

Lenti-GFP-, -αSynWT- und -αSynA53T-Viren wurden separat erzeugt, indem jedes Shuttle-Plasmid mit Lentivirus-Verpackungsplasmiden unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) in HEK293T-Zellen cotransfiziert wurde. Kurz gesagt, 2 μg jedes FUW-induzierbare Shuttle-Plasmid, 2 μg FUW-rtTA, 2 μg psPax2 und 1,5 μg MD2.G wurden gemischt und in HEK293T-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die viralen Überstände gesammelt und 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und anschließend durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Lentiviren wurden mit 8 μg/ml Polybren in MN9D-Zellen transduziert und der virale Überstand wurde entfernt und einen Tag nach der Transduktion durch frisches Medium ersetzt.

Zellulärer oxidativer Stress wurde mit dem DCFDA Cellular ROS Assay Kit (Abcam) gemäß dem Protokoll des Herstellers nachgewiesen. Kurz gesagt, Zellen, die in einer schwarzen, klaren Bodenplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät wurden, wurden mit DCFDA-Lösung (20 µM) 45 Minuten lang bei 37 °C gefärbt. Die Fluoreszenz wurde bei Ex/Em = 485/535 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Synergy HT; Bio-Tek) gemessen und die ROS-Werte wurden im Verhältnis zur Vehikelkontrolle berechnet. Die Zytotoxizität wurde durch Messung der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) in das Kulturmedium mithilfe eines LDH-Zytotoxizitätsnachweiskits (Roche)33 bestimmt. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen und die Zytotoxizität als Prozentsatz (%) relativ zu 1 % TritonX-100-Kontrolle berechnet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wie zuvor beschrieben60 bestimmt. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit 5 mg/ml MTT-Lösung (Sigma-Aldrich) 3,5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. MTT-Formazan-Kristalle wurden im 10-fachen Volumen MTT-Lösungsmittel (4 mM HCl und 0,1 % Nonidet P-40 in Isopropanol) gelöst und die Absorption des erzeugten blauen Formazans wurde bei 570 nm nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozentsatz (%) der MTT-Reduktion im Vergleich zur Vehikelkontrolle berechnet.

Die mitochondriale Aktivität wurde mit dem Seahorse XFp-Analysegerät (Agilent Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, die Zellen wurden in Vertiefungen einer XFp-Zellkultur-Miniplatte ausplattiert und über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C inkubiert. Der Assay wurde durchgeführt, nachdem die Zellen 1 Stunde lang in XF-Assaymedium, ergänzt mit 10 mM D-Glucose, 5 mM Natriumpyruvat und 2 mM Glutamax, in einem Nicht-CO2-Inkubator äquilibriert wurden. Die mitochondriale Aktivität wurde durch aufeinanderfolgende Injektionen von 1 μM Oligomycin, 2 μM Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) und 0,5 μM Rotenon/Antimycin A überwacht, um die Basalatmung (= Basissauerstoffverbrauchsrate (OCR) − Rotenon/Antimycin A) zu berechnen OCR), maximale Atmung (= FCCP OCR − Rotenon/Antimycin A OCR), ATP-Umsatz (= Baseline OCR − Oligomycin OCR) und OCR-Änderungen nach FCCP-Injektion (= FCCP OCR − Oligomycin OCR). Jeder aufgezeichnete Wert wurde auf das Gesamtprotein normalisiert, mit einem Bradford-Proteinassay (Bio-Rad) quantifiziert und mit der Seahorse WAVE Desktop-Software (Agilent Technologies) analysiert.

Primäre ventrale mesenzephale (VM) dopaminerge Neuronen wurden aus embryonalen Mäuseembryonen vom 13.5. Tag (E13.5) (C57BL/6 J; Jackson Laboratory) gewonnen. Kurz gesagt, präpariertes VM-Gehirngewebe wurde in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco gesammelt und dann mithilfe von Pipetten mechanisch dissoziiert. Anschließend wurden dissoziierte Gewebe 5 Minuten lang bei 37 °C in 0,05 % Trypsin-EDTA (Invitrogen) inkubiert. Die Zellsuspension wurde auf Glasdeckgläsern in Platten mit 48 Vertiefungen, die mit 5 mg/ml Poly-L-Ornithin, 5 μg/ml Fibronektin oder 1 μg/ml Laminin vorbeschichtet waren, in einer Differenzierungsdichte von 2,0 × 105 Zellen/cm2 ausplattiert Medium (1 % hitzeinaktiviertes FBS, 2 mM L-Glutamin, 50X B27-Ergänzung, 100 μM Ascorbinsäure und 2 μg/ml bFGF in neurobasalen Medien). Primäre VM-Neuronen wurden mit CQ (20 μM) oder 4A7C-301 (0,5 μM) mit oder ohne 6-OHDA (20 μM) behandelt und geerntet, um die dopaminerge Genexpression durch Echtzeit-PCR zu bestimmen.

Eine primäre Ratten-VM-Neuron-Glia-Kokultur wurde aus E14-Rattenembryonen (Fisher 344; Charles River)33 hergestellt. Am Tag 7 wurden die Zellen 30 Minuten vor der Behandlung mit MPP+ (0,5 μM) oder Lipopolysaccharid (LPS, 15 ng/ml) mit CQ oder 4A7C-301 vorbehandelt und dann in 4 % Formaldehyd (Sigma-Aldrich) für ICC 7 fixiert Tage nach den Behandlungen (14 Tage in vitro). Nach einstündiger Blockierung mit 10 % normalem Eselserum (NDS) und 0,1 % Triton :500; Abcam, ab5076) in 1 % NDS und 0,1 % Triton X-100-Lösung über Nacht bei 4 °C. Alexa Fluor 568- oder Alexa Fluor 488-konjugierte Anti-Kaninchen- oder Anti-Ziegen-Sekundärantikörper (1:500; Invitrogen) wurden nach der Primärantikörper-Inkubation inkubiert, und dann wurden Deckgläser mit FluoShieldTM-Eindeckmedium (Sigma-Aldrich) montiert. Fluoreszenzbilder wurden mit einem KEYENCE-Mikroskop (BZ-X800; KEYENCE) aufgenommen.

HeLa- und N27-A-Zellen wurden mit dem Tandem-mRFP-GFP-LC3-Plasmid (Addgene) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in Platten mit 24 Vertiefungen transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 6 Stunden lang in einem Hungermedium (Earle's Balanced Salt Solution, EBSS; Lonza), das Bafilomycin A1 (BafA1, 10 nM), CQ (20 µM) oder 4A7C-301 (1 µM) enthielt, inkubiert und dann fixiert mit 4 % Formaldehyd zur Fluoreszenzdetektion. Die Bilder wurden mit einem KEYENCE-Mikroskop aufgenommen und rote (mRFP) LC3-Punkte und gelbe (mRFP+GFP) LC3-Punkte wurden aus drei unabhängigen Vertiefungen für jede Behandlungsgruppe gezählt. Aus jeder Vertiefung wurden 10 Zellen zufällig ausgewählt und gezählt. Insgesamt wurden 30 Zellen für jede Behandlungsgruppe sowohl in HeLa- als auch in N27-A-Zellen analysiert.

Der lysosomale pH-Wert wurde wie zuvor beschrieben ermittelt61. Kurz gesagt, nach 6-stündiger Inkubation in EBSS mit BafA1 (10 nM), CQ (20 µM) oder 4A7C-301 (1 µM) wurden HeLa- und N27-A-Zellen mit LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (5) behandelt µM; Life Technology) für 45 Minuten, gefolgt von 2 Wäschen in HEPES-Puffer (Gibco). Fluoreszenzbilder bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 360/460 nm und 470/525 nm wurden sofort mit einem dichroitischen 400-nm-Spiegel (KEYENCE) aufgenommen. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten (F360/470) wurde manuell mit ImageJ für jede Zelle gemessen und berechnet. Der durchschnittliche pH-Wert aus der Messung von 5 Zellen aus jeder der drei Vertiefungen für jede Behandlungsgruppe in HeLa- und N27-A-Zellen wurde berechnet, indem die F360/470-Werte an eine aufgezeichnete pH-Kalibrierkurve mit KCl/NaCl, gepuffert von pH 3,5 bis 7,0, angepasst wurden GraphPad Prism (Version 8.0.2).

Der autophagische Fluss wurde durch Western Blot gegen LC3B (1:1.000; Cell Signaling, #2775) oder SQSTM1/p62 (1:1.000; Abcam, ab155686) aus Zellen bestimmt, die 0,5, 1, 2 und 4 Stunden nach der Autophagie-Induktion geerntet wurden. Die Bandenintensitäten wurden mit ImageJ quantifiziert und gegen β-Actin normalisiert.

Männliche C57BL/6 J-Mäuse (8–10 Wochen, 25–30 g; Jackson Laboratories) wurden zufällig fünf Gruppen zugeteilt, darunter Vehikel (VEH), MPTP, MPTP + L-DOPA, MPTP + CQ und MPTP + 4A7C-301 ( n ≥ 7 für jede Gruppe). MPTP (Sigma-Aldrich) wurde 5 Tage lang (Tag 1–5) intraperitoneal (ip) injiziert (30 mg/kg). Verschiedene Dosierungen von CQ (20, 40 und 80 mg/kg) und 4A7C-301 (1, 5, 20 mg/kg) wurden zunächst getestet, um das effektive Dosisfenster zu bestimmen, dann wurden schließlich Dosen von 40 und 5 mg/kg ausgewählt CQ bzw. 4A7C-301 zeigen die deutlichsten Effekte. CQ oder 4A7C-301 wurde in PBS gelöst und 16 Tage lang (ip) verabreicht, beginnend mit der MPTP-Injektion (Tag 1–16). Um dyskinetisches unwillkürliches Verhalten zu testen, wurde eine Gruppe mit L-DOPA-Injektionen einbezogen, die 16 Tage lang (Tag 1–16) 50 mg/kg L-DOPA und 15 mg/kg Benserazid (Sigma-Aldrich) (ip) erhielt. Alle Verbindungen wurden 6 Stunden nach der MPTP-Injektion verabreicht, um jegliche Auswirkungen der Verbindungen auf den MPTP-Metabolismus im Gehirn zu vermeiden. An den folgenden Tagen wurden motorische und nichtmotorische Verhaltenstests durchgeführt, wie in Abb. 4a beschrieben, und zwar im Rahmen einer vom Prüfer und Beobachter verblindeten Methode. Drei Tage vor den Injektionen wurden ein Vortraining und eine Grundeinstellung für motorisches Verhalten durchgeführt. Die Mäuse wurden getötet und einer Immunhistochemie unterzogen. Die Mäuse wurden in den Tierpflegeeinrichtungen des McLean Hospital unter einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkel-Zyklus, Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Tiere wurden gemäß dem Institutional Animal Care and Use Committee des McLean Hospital (Protokoll-Nr.: 2015N000002) und den Richtlinien der National Institutes of Health behandelt.

Adeno-assoziierte Viren (AAVs), die nur GFP oder αSyn (Wildtyp oder A53T) exprimieren, wurden freundlicherweise von Dr. Yoon Seong Kim von der University of Central Florida zur Verfügung gestellt. Rekombinante AAV-Vektoren wurden unter Verwendung von modifiziertem pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) hergestellt, um Wildtyp- und mutiertes menschliches αSyn unter der Kontrolle des CMV-Promotors zu exprimieren. Viruspartikel (AAV2) wurden am Viral Vector Core der University of Iowa gemäß Standardarbeitsanweisungen hergestellt (https://medicine.uiowa.edu/vectorcore/). Männliche C57BL/6-Mäuse (8–10 Wochen, 25–30 g; Jackson Laboratories) wurden zufällig 7 Gruppen zugeteilt, darunter leerer Vektor (GFP) + VEH, Wildtyp-αSyn (αSynWT) + VEH, mutiertes αSyn (αSynA53T) + VEH, αSynWT + CQ, αSynA53T + CQ, αSynWT + 4A7C-301 und αSynA53T + 4A7C-301 (n = 8 pro Gruppe). AAV-Vektoren wurden einseitig durch stereotaktische Chirurgie in die Substantia nigra eingeführt. Mäuse wurden mit einem Gasgemisch aus Sauerstoff und Isofluran (2,5 % Einleitung, 1,8 % Erhaltung) anästhesiert und die AAV-Vektoren wurden in die linke Hemisphäre abgegeben (A/P –3,2 mm; M/L –1,4 mm; D/V – 4,5 mm) als einzelne 2-µl-Injektion von 2,0 × 1012 genomischen Partikeln pro ml (gp/ml) mit einer Geschwindigkeit von 0,2 µl/min. Die Verabreichung von CQ (40 mg/kg/Tag) oder 4A7C-301 (5 mg/kg/Tag) wurde 4 Wochen nach den AAV-Vektorinjektionen begonnen und 5 Wochen lang fortgesetzt, bevor sie 8 Wochen nach der Operation getötet wurde.

Mäuse wurden 2 Tage lang auf einer automatisierten 5-spurigen Rotarod-Einheit (10 U/min, 3 Min.) vortrainiert und die Grundlinie wurde vor dem Rotarod-Test (3 Tage vor der MPTP-Injektion oder dem ersten Rotarod) gemessen (10 U/min, 90 Sek.). Test in Woche 2). Rotarod-Messungen wurden unter Verwendung eines Beschleunigungsprotokolls durchgeführt, bei dem 5 Minuten lang sanft von 2 auf 30 U/min beschleunigt wurde. Die Zeit auf der rotierenden Stange wurde automatisch gemessen, indem ein Auslöseschalter unter dem Boden unter der rotierenden Trommel angebracht wurde.

Den Mäusen wurde beigebracht, zwei Tage lang einmal pro Tag einen mit rauem Klebeband umwickelten vertikalen Metallstab (80 cm hoch, 12 mm Durchmesser) herabzusteigen, und dann wurde die Grundlinie vor dem Stangentest (3 Tage vor der MPTP-Injektion oder der ersten Stange) gemessen Test in Woche 2). Die Mäuse wurden mit dem Kopf nach oben auf die Stange gelegt und die gesamte Abstiegszeit wurde aufgezeichnet.

Mäuse wurden in einen transparenten Kunststoffzylinder (15,5 cm hoch, 12,7 cm Durchmesser) mit einem Spiegel dahinter gesetzt. Die spontane Aktivität wurde aufgezeichnet und anhand der Anzahl der Aufzuchtereignisse während einer 3-minütigen Sitzung gemessen. Ein Hintern wurde nur in Betracht gezogen, wenn die Maus mit ihren Vorderpfoten die Wand des Zylinders berührte, während sie auf ihren Hinterbeinen stand (vertikale Bewegung), um sinnvolle physiologische Bewegungen zu zählen.

Der olfaktorische Diskriminierungstest wurde basierend auf Prediger et al. entwickelt. 62. Kurz gesagt, Mäuse wurden in eine Kammer (40 (B) × 20 (T) × 20 (H) cm) gebracht, die in zwei identische Kammern unterteilt war, die auf einer Seite frisches Sägemehl (unbekannter Geruch) und auf einer Seite unverändertes Sägemehl (bekannter Geruch) enthielten ; 3 Tage vor dem Test beibehalten) auf der anderen Seite. Mäuse konnten zwischen dem einen oder anderen Bereich wählen, indem sie 5 Minuten lang frei durch eine offene Tür gingen. Die Bewegungen der Mäuse wurden mit EthoVision XT Version 7.0 (Noldus) überwacht und die in jedem Kompartiment zurückgelegte Zeit (s) und Distanz (cm) aufgezeichnet und analysiert.

Abnormale unwillkürliche Bewegungen (AIMs) wurden mithilfe der entwickelten Bewertungsskala für Mausdyskinesien bewertet, wie in Sebastianutto et al. beschrieben. 48. Kurz gesagt, wurden 4 Mäuse gleichzeitig mit einem Swann HD-Sicherheitssystem (B&H Photo-Video Inc.) für 2 Minuten pro Sitzung aufgezeichnet, alle 20 Minuten während der 140 Minuten nach den Medikamenteninjektionen (d. h. insgesamt 7 Sitzungen) bei jeder zweiten Sitzung oder dritter Tag (Tag 2, 4, 7, 9, 11, 13 und 16). Dyskinetische Bewegungen wurden für 3 Subtypen grundlegender AIMs, einschließlich axialer, vorderbeiniger und orolingualer AIMs, bewertet, basierend auf der Schweregradskala von 0 bis 4, die die Dauer von AIMs misst (0 = keine Dyskinesie; 1 = sichtbare Dyskinesie für <50 % der Beobachtung). Zeit; 2 = Dyskinesie für >50 % der Beobachtungszeit zeigen; 3 = Dyskinesie während des gesamten Beobachtungszeitraums zeigen, aber bei äußeren Reizen aufgehört; 4 = kontinuierliche und unaufhörliche Dyskinesie zeigen). Um eine bessere und empfindlichere Validierung der Dyskinesie von Mäusen zu erhalten, haben wir einen Amplituden-AIMs-Score einbezogen, der den Grad der Abweichung eines Körperteils oder der Muskelposition von seiner Ruheposition auf einer Skala von 0 bis 4 bewertet, wie zuvor beschrieben8. Schließlich wurde der globale AIMs-Score berechnet, indem die Basis-AIMs- und Amplituden-AIMs-Scores für jeden Subtyp in jeder Sitzung multipliziert wurden. Die Datenpunkte wurden als Gesamtsumme der einzelnen AIM-Werte an jedem Testtag aufgezeichnet.

Perfundiertes Maushirngewebe wurde mit einem Leica-Kryostat (CM 1950) in eine Dicke von 30 μm geschnitten. Nach der Inkubation in Blockierungslösung (1 % Pferdeserum (HS) und 0,3 % Triton X-100 in PBS (pH 7,4)) wurden Gehirnschnitte mit den folgenden Primärantikörpern inkubiert: TH (1:1.000; Millipore, MAB318), Iba -1 (1:2000; Abcam, ab178846), Nurr1 (1:1.000), Phospho-S129 (1:5.000; ab51253), GFP (1:500; Aves Labs, GFP-1010). Für die IHC wurden sekundäre biotinylierte Anti-Maus- (1:200; Vector Laboratories, BA-2001) oder Anti-Kaninchen- (1:1.000; BA-1100) IgG-Antikörper verwendet, gefolgt von einer Reihe von Avidin-Biotin-Komplexen (ABC; Vector Laboratories). ) und 3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich) Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für IF wurden Sekundärantikörper Alexa Fluor® 568 Anti-Maus (1:500; Life Technologies, A11031) und Alexa Fluor® 488 Anti-Huhn (1:500; Life Technologies, A11039) verwendet. Die Bilder wurden mit einem KEYENCE-Mikroskop aufgenommen und mithilfe der ImageJ-Software als Anzahl oder optische Dichte immunreaktiver Zellen quantifiziert.

Die Anzahl der TH+ DA-Neuronen, NeuN+-Neuronen, pS129 αSyn+-Zellen im SN und Iba-1+-Mikroglia im SN und Striatum wurde stereologisch in sechs koronalen Schnitten (30 µm Dicke) gezählt, die jeweils alle 6 Schnitte (180 µm-Intervalle) entnommen wurden Gehirn. Die Grenzen des SN und des Striatums wurden bei geringer Vergrößerung (4-fach) abgegrenzt, um die jeweilige Gesamtfläche abzuschätzen. Immunreaktive Zellen wurden anhand von Bildern gezählt, die von einem einfach verblindeten Untersucher mit hoher Vergrößerung (×40) aufgenommen wurden. Der Gruppenmittelwert der Gesamtzahl der immunreaktiven Zellen aus jedem Gehirn wurde als Prozentsatz der Zahl in der Kontrollgruppe (%) transformiert. Bei AAV-αSyn-induzierten Mäusen wurde der Gruppenmittelwert der Gesamtzahl der Zellen auf der ipsilateralen Seite als Prozentsatz der auf der kontralateralen Seite beobachteten Zahl transformiert.

Die endogenen Dopaminspiegel in den Hirngewebeextrakten von mit CQ oder 4A7C-301 behandelten MPTP- oder AAV-αSyn-injizierten Mäusen wurden mit einem Maus-Dopamin-ELISA-Kit (MyBiosource) wie zuvor beschrieben bestimmt33. Bei MPTP-induzierten Mäusen wurde die linke Hemisphäre jeder Gruppe (n = 5) zur Analyse verwendet und mit der mit Vehikel behandelten Gruppe (VEH) verglichen. Für das AAV-αSyn-injizierte Mausmodell wurde die mit dem Virusvektor injizierte Seite (linke Hemisphäre; ipsilateral) jeder Gruppe (n = 3) mit der nicht injizierten Seite (rechte Hemisphäre; kontralateral) verglichen.

Die letzte Dosis von 2 mg/ml 4A7C-301, gelöst in Kochsalzlösung, wurde SD-Ratten (männlich, 7–9 Wochen, n = 3 pro Gruppe) oral verabreicht. Um die 4A7C-301-Konzentration im Gehirn zu messen, wurden Ratten vor der Gehirnentnahme vollständig entblutet, um restliches Blut zu entfernen. Gehirn- und Blutproben wurden 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 und 24 Stunden nach der Verabreichung entnommen. Für die Quantifizierung von 4A7C-301 in Plasma und Gehirn wurde eine robuste LC-MS/MS-Methode mit einer unteren Quantifizierungsgrenze (LLOQ) von 1 ng/ml und 0,5 ng/ml entwickelt. Die Genauigkeit aller akzeptierten QC-Proben von 4A7C-301 bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen erfüllte die Akzeptanzkriterien. Isolierte Gehirne wurden in PBS im Verhältnis Gehirngewicht (g) zu PBS-Volumen (ml) von 1:3 homogenisiert. Die gewünschten Reihenkonzentrationen der Arbeitslösungen wurden durch Verdünnen der Stammlösung des Analyten mit 50 % Acetonitril in Wasserlösung erreicht. 5 µL Arbeitslösungen (5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 5000 ng/ml) wurden zu 50 µl männlichem SD-Ratten-Leerhirnhomogenat hinzugefügt, um Kalibrierungsstandards von 0,5 bis 500 ng/ml (0,5) zu erreichen , 1, 2, 5, 10, 50, 100, 500 ng/mL) in einem Gesamtvolumen von 55 μl. Vier Qualitätskontrollproben mit 1,5 ng/ml, 3 ng/ml, 50 ng/ml und 400 ng/ml für Gehirnhomogenat wurden unabhängig von den für die Kalibrierungskurven verwendeten Proben hergestellt. Diese QC-Proben wurden am Tag der Analyse auf die gleiche Weise wie Kalibrierungsstandards vorbereitet. 55 μl Standards, 55 μl QC-Proben und 55 μl unbekannte Proben (50 μl Gehirnhomogenat mit 5 μl Blindlösung) wurden jeweils zu 200 μl Acetonitril enthaltender IS-Mischung zur Ausfällung von Protein hinzugefügt. Anschließend wurden die Proben 30 Sekunden lang gevortext. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 4 °C und 4000 xg wurde der Überstand fünfmal mit Wasser verdünnt. 25 µl verdünnter Überstand wurden zur quantitativen Analyse in das LC-MS/MS-System (AB API 5500 + LC-MS/MS-Instrumente (Seriennummer EX224682008)) injiziert. Um die 4A7C-301-Konzentration im Plasma zu messen, wurden Serumproben aus dem gesammelten Blut entnommen und wie oben angegeben mit dem LC-MS/MS-System analysiert.

Für alle statistischen Analysen wurde GraphPad Prism (Version 8.0.2) verwendet und die verwendeten spezifischen Tests sind in den Legenden der Abbildungen beschrieben. Die Daten wurden zwischen zwei Gruppen oder innerhalb einer Gruppe mithilfe des Student-t-Tests und zwischen mehreren Gruppen mithilfe einer ein- oder zweifaktoriellen ANOVA verglichen, gefolgt von Post-hoc-Tests mit Mehrfachvergleichen von Tukey, Dunnett oder Bonferroni. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und die statistische Signifikanz wurde für P < 0,05 akzeptiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse (NS127391 und OD024622; an K.-SK), den Parkinson's Cell Therapy Research Fund am McLean Hospital (an K.-SK) und durch SERB-Zuschüsse (Science and Engineering Research Board) (EMR/2014) unterstützt /001127; an DSR) von der indischen Regierung. DSR dankt außerdem USIC-CIF, Universität Delhi für analytische Daten zu chemischen Verbindungen.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Woori Kim, Mohit Tripathi.

Abteilung für Psychiatrie, McLean Hospital, Harvard Medical School, Belmont, MA, 02478, USA

Woori Kim, Chunhyung Kim, Young Cha, Melissa Feitosa, Eric Sah, Yehan Kim, Sanghyeok Ko, Kaiya Bhatia, Young-Bin Kong, Bruce Cohen und Kwang-Soo Kim

Labor für Molekulare Neurobiologie, Programm für Neurowissenschaften, McLean Hospital, Harvard Medical School, Belmont, MA, 02478, USA

Woori Kim, Chunhyung Kim, Young Cha, Melissa Feitosa, Eric Sah, Yehan Kim, Sanghyeok Ko, Kaiya Bhatia, Young-Bin Kong und Kwang-Soo Kim

Fakultät für Chemie, Universität Delhi, Delhi, 110007, Indien

Mohit Tripathi, Satyapavan Vardhineni, Shamseer Kulangara Kandi, Rohit Kholiya, Anuj Thakur, Sunny Manohar, Gagandeep Sindhu und Diwan S. Rawat

Institut für neurologische Therapeutik, Rutgers University, Piscataway, NJ, 08854, USA

Yoon-Seong Kim

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WK, MT, DSR und K.-SK haben die Studie entworfen. WK führte die meisten Experimente und Analysen durch. MT, SV, SKK, RK, AT, SM und GS führten synthetische Verfahren durch und bestätigten sie. CK hat Hochdurchsatz-Assaysysteme etabliert. YC führte einen mitochondrialen Aktivitätstest durch. SK erzeugte Lentiviren. MF, ES, Y.-BK, YK und KB trugen zu In-vivo-Experimenten bei. Y.-SK stellte AAV-Vektoren zur Verfügung. Y.-SK und BC lieferten intellektuellen Input. WK, MT, DSR und K.-SK haben das Manuskript geschrieben, mit Diskussion und Feedback aller Co-Autoren.

Korrespondenz mit Diwan S. Rawat oder Kwang-Soo Kim.

WK, MT, SV, SKK, RK, AT, DSR und K.-SK sind Miterfinder einer anhängigen US-Gebrauchsmusteranmeldung Nr. 18/013.155, die der McLean Hospital Corporation und der University of Delhi zugeordnet ist. Die Patentanmeldung Nr. 18/013,155 beschreibt und beansprucht Verbindungen einschließlich SPV-94 (4A7C-301), die in diesem Manuskript beschrieben werden, sowie Methoden zur Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen. K.-SK ist Mitbegründer von NurrOn Pharmaceutical, Inc., das im Rahmen einer Lizenzvereinbarung mit der McLean Hospital Corporation die Rechte zur Entwicklung der in diesem Manuskript offenbarten Verbindungen besitzt. Bei den übrigen Autoren bestehen keine Interessenkonflikte.

Nature Communications dankt Michael Henderson und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kim, W., Tripathi, M., Kim, C. et al. Ein optimierter Nurr1-Agonist sorgt in Parkinson-Modellen für krankheitsmodifizierende Wirkungen. Nat Commun 14, 4283 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39970-9

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Eingegangen: 29. Dezember 2022

Angenommen: 05. Juli 2023

Veröffentlicht: 18. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39970-9

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